Дз 122а: Обзор технических характеристик атогрейдера ДЗ 122 и ДЗ 122а от XCMG

ДЗ-122 () (ДЗ-122, ДЗ-122А)- описание, характеристики, история.

Автогрейдер предназначен для:
— Производство планировочных работ при строительстве насыпей и выемок земельного полотна автомобильных и железнодорожных дорог;
— планеровка площадей и поверхностей;
— устройство корыта для слоев дорожной одежды;
— смешивание грунтов с добавками органических и минеральных вяжущих материалов на полотне дороге;
— ремонт и содержание дорог и обочин;
— очистка дорог от снега;

 

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Муфта сцепления	Двухдисковая, постоянно замкнутая
Коробка передач	Гидромеханическая
Задний мост:главная передача	Двухступенчатая
Тормоза рабочие	Колодочные на все ведущие колеса, двухконтурные гидроуправляемые, с гидроусилителем
Тормоз стояночный	Колодочный, с гидравлическим управлением
Управление рабочими органами	Гидравлическое / механическое
Рулевое управление	Гидростатическое
Управление муфтой сцепления	Механическое с гидроусилителем
Тип ходовой части	С пневматическими колесами
Колесная схема	1-2-3
Размер шин, дюйм	14-20
Количество шин	6
Тип рамы	Шарнирно-сочлененная
Угол складирования рамы в обе стороны, град	До 30
Смещение колес переднего моста относительно заднего, мм	До 2000
Скорость движения, км/ч:
— вперед	I — до 7,4; II — до 13,4; III — до 25,4; IV — до 43,0
— назад	I — до 7,7; II — до 25,2
Длина, мм	10150
Ширина, мм	2500
Высота, мм	3550
Масса эксплуатационная, кг	14600

Рабочее оборудование:

Грейдерный отвал: основной рабочий орган автогрейдера, который имеет универсальную установку в пространстве для производства работ, специфичных для автогрейдера.

• длина, мм: 3744
• высота (по хорде), мм: 632
• угол резания, град: до 30–70
• угол срезаемого откоса, град: до 90
• боковой вынос отвала в обе стороны, мм: до 800

 

Бульдозерный отвал: бульдозер автогрейдера используется для продольного перемещения грунта и других дорожно-строительных материалов, на отсыпке небольших насыпей, на засыпке небольших ям или котлованов и траншей, а также на других работах, связанных с планировкой. В зимнее время бульдозер может быть эффективно использован на очистке снега.

• длина, мм: 2527
• высота, мм: 860

 

Кирковщик: кирковщик предназначен для вскрытия плотных грунтов, изношенного полотна дороги, скалывания льда и прочих работах связанных с изменением плотности дорожно-строительных материалов.

• ширина киркования, мм: 1318
• глубина киркования, мм: 260
• число зубьев: 3

 

Технические характеристики грейдера ДЗ 122, автогрейдера дз-122, avto greider dz

Главная ⇒ Грейдер ДЗ / ГС⇒ Грейдер / автогрейдер ДЗ 122А⇒ Технические характеристики грейдера

• Грейдер ДЗ 122 А — завод изготовитель «Дормаш», предназначен для выполнения планирования земляного полотна дороги, возведения насыпных сооружений, планирование площадей, устройству дороги так называемому корыто, а также для смешивания грунтов с добавками и вяжущими материалами на полотне дороги. Его используют для ремонта и содержания дорог и обочин, очистки снега, рыхления асфальтовых покрытий, булыжных мостовых и тяжелых грунтов. Может работать на грунтах I — III категории. Температурный режим эксплуатации окружающей среды -40°С…+40°С в условиях умеренного и тропического климата.
• Грейдер ДЗ 122 А и его модификации по конструкции аналогичны модели ДЗ 143 Брянского производства и имеют много унифицированных узлов.
• Грейдер ДЗ 122 А оснащен двигателями А-01МС с электростартером или А-01М с пусковым двигателем, с электростартером. На автогрейдере ДЗ 122А установлен мощный рыхлитель-кирковщик, расположенный сзади.
• ДЗ-122 применяют 3-и вида коробок передач: Гидромеханической (ГМКП) с 4-мя передачами вперед и 2-мя назад. Механической с 6-ю передачами вперед и передаточным числом на повышеной передаче равной (i = 0,62), и 2-мя передачами назад. Механической (МКПП)с 6-ю передачами вперед и передаточным числом на повышеной передаче равной (i = 0,835) и 2-мя передачами назад.
• Автогрейдер ДЗ-122А в настоящее время снят с производства и не выпускается. Запчасти на, грейдер есть у нас.

Основные части автогрейдера производства Орел. Скелет конструкции базируется на раме. Она бывает двух видов: цельная и сочлененная рама основная. Цельная уже изначально само название говорит о том, что рама имеет жесткую конструкцию в отличии от сочлененный. Хотя у сочлененной рамы ряд своих преимуществ. Учитывая габариты грейдера, эта рама позволяет грейдеру делать меньший круг поворота и производить планировку дорог с меньшими нагрузками на кузов машины. Не малую роль в этой работе занимает кронштейн самолет дз-122А.01.04.000. К нему крепятся гидроцилиндры для подъема и выноса тяговой рамы. На автогрейдере ДЗ 122 используются 8 гидроцилиндров и у каждого свое назначение. Следующий элемент машины Бульдозер-кирковщик ДЗ-122А.30.00.000. Он состоит из рамы рыхлителя, кирки, отвала и других более мелких деталей.

А основной частью бульдозер-кирковщика является бульдозерный отвал (лопата) ДЗ-122.А.30.01.000. В простонародии называют лопата или отвал. На него устанавливают ножи или тех пластины. Данная установка подразумевает под собой, какой вид работы нужно выполнить автогрейдеру. Если это земляные работы или планировка грунта то требуются ножи и чем крепче будет сталь, тем дольше будет срок службы. В случае выполнения работ по очистке от снега или других загрязнений дорожного полотна, оптимально использование техпластин. Техпластины. Каталог их применения зависит от характера загрязнения. Отвал (лопата) управляется в рабочее состояние или же для транспортировки до участка работы при помощи гидроцилиндров. Гидроцилиндр подъема бульдозера ДЗ-122А.08.02.000-01. Так же для основной работы, для которой и была придумана, и сделана эта машина — это рыхлитель. Он врезается в грунт и рыхлит его. На Орловском грейдере устанавливается

рыхлитель-кирковщик ДЗ-122Б. 19.00.000-01. Как и отвал, кирковщик имеет быстросменные расходные матерьялы, так называемые зубья. Для ДЗ-122 их маркировка кирка – зуб в сборе ДЗ-122.30.00.002. Они изготавливаются из высокопрочной стали. Механизм приведения в рабочее состояние осуществляется при помощи все тех же гидроцилиндров. На Орловском используется гидроцилиндр подъема рыхлителя ДЗ-122Б.08.05.000-02. Автогрейдер ДЗ 122 базируется на двух мостах, мост передний и мост задний. Мост передний ДЗ-122А, ДЗ-122А.03.00.000, состоит из балки, на которую устанавливаются оси, шатуны, тяги, наконечники и т.д. В данном узле основную нагрузку получают подшипники и кулак поворота. Имеет место выходить из строя и ступица передняя ДЗ 122А. ДЗ-122А.03.03.000 ее каталожный номер. Управление мостом осуществляется при помощи тяги. Так называемая тяга рулевая ДЗ 122А.03.04.000, а на концы тяги крепятся наконечники. С самой тягой если ее не погнуть, ничего не случится, а вот наконечники со временем изнашиваются и их приходится менять. На мосту установлены два вида гидроцилиндров. Гидроцилиндр рулевого управления левый ДЗ-122.06.30.000-01 и правый ДЗ-122.06.30.000-03, с их помощью грейдер производит поворот машины по ходу своего движения вправо либо влево. Второй вид цилиндров — Гидроцилиндр наклона колес ДЗ-122А.03.25.000 позволяет автогрейдеру совершать меньший круг поворота, т.к. они наклоняют колеса в сторону поворота машины. Задний мост или Тележка задняя ДЗ-122А.04.00.000 состоит из редуктора, балансиров, тормозов колесных и ручного. На Орловском автогрейдере ДЗ 122 это основной ведущий мост в отличии от Брянского ДЗ-180 полно приводного, там ведущие мосты оба передний и задний. На Орловском, задней тележке установлен редуктор заднего моста ДЗ 122 А / Б, который состоит из корпуса, подшипников, чулок, фланцев, шестерен, валов и хвостовика. Он передает крутящий момент от коробки передач через хвостовик на ведомую шестерню, а та в свою очередь на шестерни балансиров. Балансир ДЗ 122, ДЗ 122.04.06.000 каталожный номер, состоит из группы шестерен получающих крутящий момент от редуктора и передающий его на колеса. Наиболее изнашиваемая деталь в балансире – шестерня паразитная или паразитка. На балансире установлен тормоз колесный ДЗ 122, каталог ДЗ 122.04.09.000 и тормоз ручной ДЗ 122 ДЗ-31-2.04.07.000 которые производят остановку или торможение машины, либо в процессе полной остановки грейдера, фиксируют последний в неподвижном положении. Рабочее оборудование ДЗ-122 в сборе представляет ряд узлов и агрегатов для выполнения определенных видов работ, либо комплексное взаимодействие оборудования для решения одной задачи. Рабочее оборудование состоит из тяговая рама ДЗ 122 А / Б, редуктор поворота отвала, круг поворотный ДЗ 122, отвал. Тяговая рама является платформой для крепления на нее всего рабочего оборудования и управляется при помощи гидроцилиндров двух видов. Один гидроцилиндр подъема тяговой рамы ДЗ-122.08.06.000 производит ее подъем, другой гидроцилиндр выноса тяговой рамы ДЗ-122.08.06.000-01 делает вынос. Механизм привода оборудования – это редуктор поворота ДЗ 122 А / Б, есть отличительные особенности в нем. Разница между редуктором А и Б в расстоянии шпилек вокруг отверстия тяговой рамы. Весь механизм приводит в нужное положение отвал ДЗ-122 (лопата). Как и передний отвал производит туже работу, но при помощи рабочего оборудования он более управляем. помимо горизонтального угла резания имеет возможность и при выносе обрабатывать вертикальную поверхность. Также как и на передний отвал устанавливаются ножи. Угол резания изменяется гидроцилиндром. Гидроцилиндр угла резания ДЗ-122.08.06.000-01. Вынос отвала для работ при вертикальной обработки поверхности производится другим гидроцилиндром. Гидроцилиндр выноса отвала ДЗ-122. 08.12.000.

---

Общие данные

Класс	122А
Длина (при поднятом бульдозере с запасным колесом), мм	2 500
Ширина (по шпилькам колеса), мм	3 250
Высота без проблескового маяка, мм	А-01МС / А-01М
Высота c проблесковым маяком, мм	3 500
База (расстояние между осью переднего моста и осью балансирной тележки), мм)	5 830
База заднего моста (между осями колес), мм	1 440
Колея передний и задних колес, мм	2 000

Ходовая часть

Тип	пневмоколесный
Число шин	6
Размер шин	14,00-20,00
Колесная схема	1х2х3
Эксплуатационная масса, кг	14 373

Управление грейдером

Управление рабочими органами	гидравлическое
Рулевое управление	гидростатистическое
Управление муфтой сцепления	механическое с гидроусилителем

Двигатель

Модель	А-01МС (дизель)
Полная мощность по SAE, КвТ	99
Частота вращения коленчатого вала при полной номинальной мощности, C-1	28,3

Тормоза

Ножные тормоза	колодочные на все ведущие колеса
Стояночный тормоз	колодочный

Трансмиссия

Муфта сцепления	двухдисковая, постоянно замкнутая
Коробка перемены передач	У35. 606-32 (гидромеханическая)

Задний мост

Главная передача	механический двухступенчатый редуктор
Бортовые передачи	шестеренные редукторы

Расчетные скорости (без учета буксирования колес при номинальной частоте вращения вала и радиуса колес 555мм) км/ч — вперед

1 передача	7,4
2 передача	13,4
3 передача	24,5
4 передача	43,0

Расчетные скорости (без учета буксирования колес при номинальной частоте вращения вала и радиуса колес 555мм) км/ч — назад

1 передача	7,7
2 передача	25,2

Рабочее оборудование

Отвал	полноповоротный
Длина, мм	3 724
Высота с ножами по хорде, мм	620
Урол резания, град.	30-70
Урол срезаемого откоса, град.	до 90
Боковой вынос отвала в обе стороны относительно тяговой рамы, мм	800
дорожный просвет под отвалом в транспортном оложении, мм, не менее	350
Заглубления, мм, не менее	250

Бульдозерный отвал

Длина, мм	2 475
Высота с ножами по хорде, мм	840
Урол резания, град.	70
Заглубления, мм, не менее	50

Криковщик

Ширина киркования, мм	1 490
Заглубление киркования, мм, не менее	250
Число зубьев	4

Электрооборудование

Схема электрооборудования	постоянный ток, однопроводная, (минус) соединен с массой
Номинальное напряжения в сети, В	12 (цепь стартера 24В)
Число зубьев	4

Производитель

Предприятие изготовитель

выпускался ЗАО «Дормаш»

Компания ООО «ТД «СПЕЦЗАПЧАСТЬ» занимается поставкой запасных частей для дорожно-строительной и коммунальной техники. Основное направлением нашей компании — это поставка запчастей на грейдера ДЗ 122, 143, 180, ГС-14.02. Запчасти в наличии на складе. Наша компания является крупным поставщиком запчастей для грейдеров ДЗ 122, 143, 180, ГС 14.02, и др. техники. Мы предлагаем по настоящему качественные запчасти, по действительно низким ценам. На сайте Вы можете ознакомиться заказать перечень основных запчастей и узлов, устанавливаемых на дорожную, коммунальную и строительную технику. Подробную информацию о поставке, запчастей на грейдер дз, Вы можете получить связавшись с нами по электронной почте или позвонив по телефону. Мы поставляем запчасти по всей территории РФ и ближнему зарубежью. Отгрузка запчастей осуществляется транспортными компаниями Байкал-Сервис, Автотрейдинг, Грузовозофф.

ООО «ТД «СПЕЦЗАПЧАСТЬ» — запчасти на грейдер, дорожно-строительную и коммунальную технику, гидрораспределители и гидроцилиндры.

Советская технология строительной техники – vulcanhammer.

info

5 декабря 2018 г. Автор Don Warrington, размещено в рубрике Компания

На этом сайте я разместил несколько статей о советской (а затем и российской) сваебойной технике, такой как дизельные молоты , сваебойные бетономешалки, вибрационные и ударно-вибрационные молоты. Это очень специализированные темы даже по стандартам строительной отрасли; здесь я хочу представить несколько фотографий, представляющих более общий интерес для вас, любителей тяжелой техники. Советский Союз был известен своей приверженностью тяжелому производству и строительному оборудованию, и это, безусловно, большая часть этого.

НПО ВНИИстройдормаш — советское название московского института, который спроектировал и испытал показанное ниже оборудование. Название означает Всесоюзный научно-исследовательский институт строительных и дорожно-строительных машин. Он был создан в 1975 году и просуществовал после распада Советского Союза в 1991 году как акционерное общество, то есть приватизированная корпорация. В дополнение к оборудованию для забивки свай, которое привлекло меня к организации, оно разработало много других типов оборудования, и лучший способ показать это следует из их каталога, произведенного около 1986.

ДЗ-110А-1 Бульдозер с лазерно-лучевой системой управления и контроля. Точность обработки поверхности +-5 см на расстоянии 10-400 мм от лазерного источника. Такая установка сегодня распространена; в то время этого не было.Аналогичная концепция лазерного нивелирования с автогрейдером ДЗ-122А-13.Экскаватор ЭО-4125. Экскаватор, пожалуй, самая универсальная и важная землеройная машина на строительной площадке. Этот был оснащен клапанами с сервоприводом, что делает современные экскаваторы более простыми в использовании, чем их более старые аналоги. Экскаваторы универсальны в том смысле, что на стрелу можно установить другие вещи, кроме обычного ковша. При этом экскаватор МТП-71А имеет удлиненную обратную лопату, используемую для больших радиусов поворота и рытья каналов. Он установлен на резиновых шинах (тот, что выше, на гусеницах) для более мягких почв; его также легче транспортировать по дорогам. Для увеличения эффективного противовеса на нем установлены выносные опоры. Экскаватор ЭО-3323 также установлен на колесах с выносными опорами. Красный ковш на конце имеет вместимость 0,75 м3. Что касается кранов, то это 12,5-тонный гидравлический автокран. Очень полезны для подъема легких грузов, они довольно распространены на строительных площадках и в других местах. 40-тонный автокран, еще один универсальный инструмент.

Наше предприятие часто использовало их для сборки больших молотов, но иногда что-то шло не по плану.

250-тонный кран. Для действительно тяжелых подъемов Vulcan мог бы использовать это для своих самых больших продуктов. Подобные краны использовались в начале 1980-х годов для модификации самого большого молота. Вибрационный каток DM-476 для уплотнения. Эти машины предназначены не для глубокого уплотнения грунтов, а для выравнивания поверхности, что необходимо при строительстве дорог и аэродромов. Автогрейдер ДЗ-140, используемый для окончательной планировки дорог перед выравниванием и мощением. Длина отвала 4,8 м. Погрузчик с бортовым поворотом ТО-31, более известный на американских рабочих площадках как «Бобкэт» в честь популярного американского бренда. Может, надо было назвать это «Сибирский тигр». Бульдозер-рыхлитель. Большинство людей связывают бульдозеры с движущейся землей, но этот предназначен для разрушения породы для удаления. Компьютерный дизайн, 19Стиль 80-х: Компьютерный зал ВНИИстройдормаш. Библиотека ВНИИстройдормаш. Женская лыжная команда ВНИИстройдормаш.

Вулкан впервые связался с Институтом в 1988 году, и наши контакты продолжались следующие шесть лет. Иногда все становилось странным, но мы обнаружили организацию, которая выпускала очень хорошие проекты строительного оборудования. К сожалению, советская производственная организация не была на должном уровне контроля качества, особенно в гражданском секторе, и эта слабость была одной из тех, которые в конечном итоге привели Советский Союз к краху.

Нравится:

Нравится Загрузка…

МикроРНК-122a регулирует зонулин путем нацеливания на EGFR при дисфункции эпителия кишечника — полный текст — клеточная физиология и биохимия, 2017, том.

42, No. 2

Предпосылки/Цели: Это исследование было направлено на изучение роли микроРНК (миР)-122a в регуляции зонулина во время модуляции кишечного барьера. Методы: Белки зонулина и экспрессия их генов-мишеней анализировали в клеточных линиях, сверхэкспрессирующих miR-122a, и в гене-мишени рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Модель mmu-miR-122a кишечного эпителия условно трансгенных (miR-122a-TG) мышей была создана для исследования экспрессии EGFR и зонулина. МиР-122а также была обнаружена в клинических образцах воспалительного заболевания кишечника. Результаты: EGFR был идентифицирован как ген-мишень miR-122a. Уровень экспрессии miR-122a положительно коррелировал с уровнем зонулина. Уровень экспрессии зонулина был значительно повышен, тогда как уровень экспрессии EGFR был значительно снижен у мышей miR-122a-TG и в соответствующей первичной культуре эпителия (P <0,05). Эти результаты согласуются с данными клинических образцов. Выводы: miR-122a может быть положительным фактором зонулина путем нацеливания на EGFR, что увеличивает проницаемость эпителия кишечника in vivo и in vitro .

Введение

МикроРНК (миРНК, миР) действуют как негативные регуляторы трансляции генов посредством ингибирования трансляции мРНК или стимулирования деградации мРНК путем связывания с их 3′-нетранслируемыми областями (3′-НТО) [1]. МикроРНК могут участвовать в регуляции экспрессии генов в различных критических биологических процессах, таких как развитие, дифференцировка, апоптоз и пролиферация [2]. Изменения экспрессии микроРНК также связаны со многими заболеваниями, включая рак [3-5], болезни сердца [2]. 6], расстройства нервной системы и нарушение функции кишечного барьера [1, 7, 8].

Связь между микроРНК и дисфункцией эпителиального барьера кишечника редко исследовалась [1, 7-11]. МакКенна и др. определили полный профиль экспрессии микроРНК в слизистой оболочке кишечника млекопитающих и вклад микроРНК в гомеостаз кишечника с использованием мутантных мышей Dicer1 ^loxP/loxP : Villin-Cre и обнаружили снижение экспрессии всех микроРНК [11]. Барьерная функция кишечника у мышей с дефицитом Dicer1 нарушена, что вызывает воспаление кишечника с инфильтрацией лимфоцитами и нейтрофилами. Фактор некроза опухоли альфа (TNF)-α может быстро повышать экспрессию miR-122a в энтероцитах, культивируемых клетках и тканях кишечника и, следовательно, индуцировать деградацию мРНК окклюдина и повышать проницаемость кишечника [11]. Зонулин представляет собой белок, обнаруживаемый в плотных соединениях кишечного тракта и секретируемый возбудителем холеры 9.0024 Vibrio cholerae , который был первоначально обнаружен в 2000 году как мишень для токсина zonula occludens [12]. Зонулин также является индикатором кишечной проницаемости [12, 13].

Также была изучена взаимосвязь между miR-122a и уровнями экспрессии зонулина. Мы предположили, что miR-122a может помочь защитить функции кишечного барьера, регулируя зонулин. Мы стремились исследовать молекулярные механизмы miR-122a в регуляции зонулина путем нацеливания на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).

Материалы и методы

Клеточная культура

Клетки Caco-2, приобретенные в ATCC (Манассас, Вирджиния), выращивали в стандартных условиях культивирования клеток и выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО ₂ . Клетки пассировали при плотности предварительного слияния с использованием 0,05% трипина и 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (Gibco, США), как описано ранее. Для разных групп добавляли 5 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) (24 ч) с диметилсульфоксидом (ДМСО) (48 ч) для лечебной группы, тогда как фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (24 ч) с ДМСО (48 ч). h) был добавлен для контрольной группы.

Трансфекция лентивируса со сверхэкспрессией miR-122a

кДНК hsa-miR-122a амплифицировали с помощью RT-PCR с геномной ДНК человека с использованием 5′-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT-3′ и 3′-ACCTCACACTCTTACCACAAAACA-5′. 5′- и 3′-праймеры содержали сайты BamHI и XhoI, соответственно, как показано подчеркиванием. Амплифицированную кДНК встраивали в сайты BamHI и Xho I экспрессионного плазмидного вектора млекопитающих, PGIP2 (Promega), в сайт ниже промотора цитомегаловируса. Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали с помощью набора плазмид Qiagen (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) и использовали для трансфекции клеток NCM460. Ориентацию вставки подтверждали секвенированием. После проведения трансфекции с использованием реагента Tfx-50 (Promega) клетки культивировали в присутствии G418 и через 2 недели собирали устойчивые к G418 колонии. Клеточные клоны размножали индивидуально, и клоны, экспрессирующие высокие уровни hsa-miR-122a на своей поверхности, отбирали с помощью проточного цитометрического анализа с SN2Ab. В этом исследовании использовали клон (обозначенный как h21-SN2), который экспрессировал hsa-miR-122a на клеточной поверхности на том же уровне, что и клетки NCM460 [14].

Создание и идентификация трансгенных мышей miR-122a

Интестинальные трансгенные мыши miR-122a (mir-122a-TG) были созданы Cyagen Biosciences Inc. (Гуанчжоу, Китай) с использованием промотора виллина и фоновых мышей C57BL/6, как описано [15]. Мышей разводили и содержали в Центре лабораторных животных Университета Сунь Ятсена (Гуанчжоу, Китай). Всех мышей выращивали в особых условиях, свободных от патогенов, с фильтрованным воздухом, кормили кормом для грызунов вволю и давали свободный доступ к воде. Генотипирование мышей проводили методом ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из хвоста с помощью набора для выделения тканевой ДНК (Biomiga, Китай). Исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Сунь Ятсена. Мышей умерщвляли в возрасте 8 недель для определения. Концентрацию зонулина в сыворотке через 24 часа после операции измеряли с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), как описано ранее [12].

Выделение кишечного эпителия и первичной культуры клеток толстой кишки

Проксимальный и дистальный отделы слепой кишки и толстой кишки вскрывали вдоль их вертикальной оси и содержимое их просвета удаляли путем промывания тканей в PBS. Каждый сегмент помещали в забуференный физиологический раствор Хэнкса (HBSS), содержащий 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты и 1% телячьей сыворотки (Sigma) (три промывки по 5 мин каждая, 20 мл/промывка). . РНК выделяли (набор RNeasy, Qiagen) из осадка клеток (эпителиальная фракция) и оставшихся фрагментов ткани (мезенхимальная фракция) [16]. Первичную культуру клеток mir-122a-TG толстой кишки проводили, как описано [17].

Пациенты

Ткани толстой кишки были получены из хирургических образцов пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), поступивших на операцию. Образцы крови собирали и хранили надлежащим образом. Клиническое исследование было одобрено этическим комитетом Шестой дочерней больницы Университета Сунь Ятсена и Пятой дочерней больницы Медицинского университета Гуанчжоу. От пациентов были получены информированные согласия.

Анализ люциферазы

Полученные фрагменты, содержащие интактные предполагаемые последовательности распознавания miR-122a из 3′-UTR или со случайными мутациями, были клонированы в векторе psi-CHECK2 (Promega), как описано ранее. Клетки Caco-2 котрансфицировали с использованием Transit-TKO (Invitrogen) с репортерными плазмидами и вектором дикого типа (WT) или мутантным вектором. Анализы люциферазы проводили через 48 ч после трансфекции в соответствии с протоколом производителя (репортерная система анализа двойной люциферазы, E19).10; Промега). Активность люциферазы измеряли с помощью системы отчетов Dual-Luciferase (Promega).

Выделение РНК

Суммарную РНК выделяли из образцов клеток или тканей с использованием лизирующего буфера Trizol (Ambion, США) согласно инструкции производителя. Выделение микроРНК из образцов клеток, тканей или сыворотки проводили с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Синтез первой цепи кДНК проводили с помощью набора для обратной транскрипции (Invitrogen, США). qRT-PCR для мРНК проводили с использованием SYBR Master Mix (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием системы 7500 Real-Time PCR. Синтез первой цепи кДНК также проводили с помощью набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (ABI, США). qRT-PCR для микроРНК проводили с использованием TaqMan microRNA Assay (ABI, США). Последовательности праймеров для qRT-PCR были следующими:

EGFR: (F) 5′-ATGGTCAAGTGCTGGATG-3′, (R) 5′-GAGGAAGGTGTCGTCTATG-3′ Зонулин: (F) 5′-TCATCACGGCGCGCCAGG-3′, (R) 5′-GGAGGTCTAGAATCTGCCCGAT-3′ Интерлейкин ( IL)-6: (F) 5′-CCAGAAGACCAGAGGAAA-3′, (R) 5′-GGAAATCGTGGAAATGAG-3′ TNF-α: (F) 5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′, (R) 5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3 ‘ Окклюдин: (F) 5′-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3′; (R) 5′-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3′ CLDN-1: (F) 5′-CTTCAGCAGACGAAGGTT-3′, (R) 5′-CATAGGCAGGACAAGAGTTA-3’.

Вестерн-блот-анализ

Для вестерн-блоттинга белки разделяли на гелях для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а затем переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Millipore, Massachusetts) с использованием мокрого электроблоттинга (Bio-Rad) в течение 120 мин при 100 В. Затем мембрану инкубировали с соответствующим первичным антителом при 4°C в течение ночи, трижды (каждый раз по 10 мин) промывали трис-буферным солевым раствором (TBS), содержащим 0,1% Tween 20 (TBS-T буфер), а затем инкубировали в течение 1 ч с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, в буфере TBS-T в течение 4 ч при 4°C. Мембрану трижды (по 60 мин) промывали буфером TBS-T и проявляли методом усиленной хемилюминесценции (набор ECL; Pierce, Illinois) согласно инструкции производителя [12]. В нашем исследовании использовались антитела к окклюдину (EPR8208, ab167161), антитела к клаудину 1 (EPRR18871, ab211737), антитела к EGFR (EP38Y, ab5289).4) и антитело против гаптоглобина (HG-36, ab13429).

Анализ проницаемости

Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TER) и проницаемости для декстрана было описано ранее [18]. Монослои кишечного эпителия были разделены на пять различных экспериментальных групп в трех повторностях. Измерение кишечной проницаемости и повреждения толстой кишки у мышей проводили, как описано ранее [18]. Окончательные данные представляли либо как фракционную экскрецию (для сукралозы) для определения проницаемости толстой кишки, либо как соотношение фракционной экскреции (для лактулозы/маннита) для количественной оценки проницаемости тонкой кишки. Фракционная экскреция определялась как доля введенной через зонд дозы, выводимой с мочой, а отношение фракционной экскреции определялось как отношение доли введенной через зонд дозы лактулозы, выведенной с мочой, к доле введенной через зонд дозы маннита, выведенной с мочой. в моче. Анализ камеры с использованием также использовали для определения измерения кишечной проницаемости в изолированных толстых кишках мышей. Ионное сопротивление ткани (1/G, где G — проводимость) рассчитывали по разности потенциалов и току короткого замыкания по закону Ома [18].

Статистический анализ

Данные были подвергнуты статистическому анализу в GraphPad Prism 5 (Сан-Диего, Калифорния) и выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводили с помощью парного критерия Стьюдента t . P <0,05 был определен как значимый.

Результаты

ЛПС оказывает повреждающее действие на плотные соединения

После введения ЛПС уровни экспрессии клаудина-1 и окклюдина значительно снижались в клетках Caco-2 (рис. 1 A и B, P <0,05), тогда как уровни экспрессии miR-122a и зонулина были повышены (рис. 1 C&D, P <0,05). Для уровня экспрессии EGFR ПЦР показала незначительное изменение (рис. 1 E, P> 0,05), тогда как Вестерн-блот показало значительное снижение (рис. 1 F, P <0,05), что может указывать на посттранскриптную регуляцию EGFR. , такие как миР-122a-индуцированная регуляция.

Рис. 1.

ЛПС имел примесь к плотному соединению кишечника. (A) LPS может снизить уровень экспрессии окклюзии и клаудина-1, определяемый с помощью qRT-PCR. (B) ЛПС может снизить уровень экспрессии окклюзии и клаудина-1, определяемый вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. (C) LPS может повысить уровень экспрессии миР-122a, определенный с помощью qRT-PCR. (D) ЛПС может повышать уровень экспрессии зонулина, определенный с помощью qRT-PCR. (E) LPS не мог снизить уровень экспрессии мРНК EGFR, определенный с помощью qRT-PCR. (F) ЛПС может снижать уровень экспрессии белка EGFR, определенный вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. * Р < 0,05. Было проведено три независимых эксперимента.

Прогнозирование EGFR как мишени miR-122a

Сайт связывания miR-122a-мишени был предсказан с использованием трех различных вычислительных программ: TargetScan (http://www.targetscan.org/) [19], PicTar (http:/ /pictar.bio.nyu.edu.), [20] и miRanda (http://www.microrna.org/) [21]. После того, как три списка были сгенерированы тремя вычислительными программами, был сгенерирован четвертый список, который содержал гены, предсказанные всеми тремя исходными вычислительными программами (табл. 1). При анализе биоинформатики MetaCore ^TM , мы выбрали EGFR в качестве кандидата с наивысшим баллом (таблица 1), который, как сообщается, может ослаблять воспаление кишечника у мышей [22].

Таблица 1.

Биоинформатический анализ оценки гена-мишени микроРНК-21

Мы сконструировали векторы 3’UTR мРНК EGFR (WT и мутантные) и вставили их непосредственно ниже репортерного гена люциферазы, чтобы определить, является ли EGFR регулируется miR-122a посредством прямого связывания ее 3′-UTR. В анализах люциферазы предшественник miR-122a или контроль совместно трансфицировали в клетки Caco-2 с различными векторами люциферазы 3′-UTR. МиР-122a значительно снижала относительную активность люциферазы в 3’UTR WT EGFR (P <0,05, рис. 2F). Напротив, относительная активность люциферазы существенно не снижалась в UTR с сайтами связывания мутантов.

Рис. 2.

EGFR может быть геном-мишенью miR-122a. (A) Сверхэкспрессия миР-122a увеличивала уровень экспрессии зонулина, в то время как не указывала на изменение EGFR, определенное с помощью qRT-PCR (B). (C) Сверхэкспрессия miR-122a повышала уровень экспрессии зонулина и EGFR, определяемый вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. (D, E) Совместная сверхэкспрессия miR-122a и EGFR продемонстрировала аналогичные эффекты на экспрессию зонулина по сравнению с единичной сверхэкспрессией EGFR, которая охватывала эффекты miR-122a как на уровне экспрессии мРНК, так и на уровне белка, определяемом с помощью qRT- ПЦР, вестерн-блоттинг и полуколичественный анализ, тогда как только сверхэкспрессия мутантной формы miR-122a не указывала на разницу с контролем. (F) Анализ люциферазы показал, что мишенью miR-122a может быть 3′-UTR EGFR. * Р < 0,05. ** против *, Р > 0,05. Было проведено три независимых эксперимента.

qRT-PCR и вестерн-блоттинг показали, что miR-122a может снижать уровень экспрессии зонулина в клеточной линии Caco-2, трансфицированной предшественником miR-122a (рис. 2 A и C, P <0,05). Однако уровень экспрессии EGFR был значительно снижен только на уровне белка с помощью вестерн-блоттинга, а не на уровне мРНК, обнаруженном с помощью qRT-PCR (рис. 2 B и C, P <0,05). Совместная трансфекция miR-122a и EGFR в клетки Caco-2, приводящая к снижению экспрессии зонулина, сходному с однократной трансфекцией EGFR, указывает на то, что miR-122a может оказывать EGFR-зависимое действие на экспрессию зонулина (рис. 2 D&E, P <0,05). ). Однако сверхэкспрессия мутантной формы miR-122a не имела существенных отличий от контроля (рис. 2D, P> 0,05).

Уровень экспрессии miR-122a коррелировал с уровнем экспрессии зонулина

Эксперименты in vivo также проводились на мышах miR-122a-TG для определения влияния miR-122a на кишечный барьер. Ткани толстой кишки были выполнены для qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Уровень экспрессии зонулина был более значительно повышен у мышей miR-122a-TG, чем в группе WT, что было обнаружено с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга, что согласуется с результатами в клеточной линии Caco-2, как сообщалось выше (рис. 3A и C). . Напротив, уровень экспрессии EGFR был снижен более значительно у мышей miR-122a-TG, чем в группе WT, обнаруженной только вестерн-блоттингом (рис. 3B и C). Аналогичные результаты были получены для первичной клеточной культуры эпителия miR-122a-TG (MCE-TG, рис. 3 D-F).

Рис. 3.

МиР-122а кишечные трансгенные мыши получили более высокий уровень экспрессии зонулина. (A) Мыши MiR-122a-GT имели повышенный уровень экспрессии зонулина в кишечнике, определенный с помощью qRT-PCR. (B) У мышей MiR-122a-GT не было сниженного уровня экспрессии EGFR в кишечнике, определенного с помощью qRT-PCR. (C) Мыши MiR-122a-GT имели более высокий уровень экспрессии зонулина и сниженный уровень кишечной экспрессии EGFR, определенный вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. (D, E, F) Первичная культура клеток показала аналогичные результаты. * Р < 0,05. Было проведено десять независимых экспериментов.

MiR-122a усиливала проницаемость кишечника и воспаление in vitro и in vivo

Масса тела мышей miR-122a-TG была значительно меньше, чем у контрольной группы через 8 и 12 недель. (P <0,05, рис. 5A). Наблюдалась высокая смертность мышей miR-122a-TG. TER был значительно ниже после трансфекции miR-122a в клетки Caco-2, тогда как относительная интенсивность была значительно выше (P <0,05, рис. 4A). Использование камерного анализа и фракционной экскреции (для лактулозы/маннита) также показало более высокую проницаемость мышей miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой WT. Анализы qRT-PCR показали, что экспрессия IL-6 и TNF-α на уровнях мРНК в сыворотке значительно увеличилась у мышей miR-122a-TG по сравнению с группой WT. (P <0,05, рис. 4B, C)

Рис. 4.

MiR-122a может привести к повышению проницаемости кишечника. (A) Трансэпителиальное электрическое сопротивление было снижено после сверхэкспрессии miR-122a в клетках Caco-2. (B) Относительная интенсивность увеличилась после сверхэкспрессии miR-122a. (C) Поток маннита был увеличен у мышей группы miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой дикого типа. (D) Устойчивость была снижена у мышей группы miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой дикого типа. (E) Уровень лактулозы/маннита был выше в группе miR-TG по сравнению с контрольной группой WT на 4, 8 и 12-недельных мышах. (F) Экскреция сукралозы была выше в группе miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой мышей дикого типа в возрасте 4 лет, в возрасте 8 лет и 12-недельных мышей в возрасте 9 лет.0024 in vivo . * Р < 0,05, ** Р < 0,05. Было проведено три независимых эксперимента для клеточного теста и десять для мышей.

Рис. 5.

МиР-122а может вызывать воспаление кишечника. (A) Масса тела мышей miR-122a-TG была ниже у мышей в возрасте 8 и 12 недель. (B, C) Уровни IL-6 и TNF-α были выше у мышей miR-122a-TG по сравнению с группой WT в крови мышей. (D, E) Уровень экспрессии miR-122a и зонулина был выше у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника по сравнению с контрольной группой добровольцев в тканях толстой кишки. (F, G) Уровни IL-6 и TNF-α были выше у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника по сравнению с контрольной группой добровольцев в крови. * Р < 0,05, ** Р < 0,05. Было проведено десять независимых экспериментов.

Клинические образцы также использовали для исследования клинических признаков miR-122a. Свежие ткани толстой кишки ВЗК и парные соседние нормальные ткани толстой кишки собирали для определения уровня экспрессии mR-122a в тканях с помощью qRT-PCR. Уровни миР-122a в тканях толстой кишки при ВЗК были значительно выше, чем в парных соседних нормальных тканях толстой кишки. (P <0,05, рис. 5D). Экспрессия зонулина на уровнях мРНК увеличилась в тканях толстой кишки при ВЗК по сравнению с парными соседними нормальными тканями толстой кишки. (P <0,05, рис. 5E). Уровни IL-6 и TNF-α в сыворотке, определенные с помощью набора ELISA (RayBiotech, США), были повышены у пациентов с ВЗК, чем у здоровых добровольцев. (P <0,05, рис. 5F, G)

Обсуждение

Кишечный барьер в основном состоит из целых эпителиальных клеток кишечника [23] с плотным соединением между соседними клетками [24, 25]. Кишечник человека сталкивается с наибольшей бактериальной нагрузкой, примерно более 500 различных видов микроорганизмов [26]. Поэтому мы стремимся исследовать взаимосвязь между микроРНК и барьерной функцией кишечника.

TNF-α может повышать экспрессию miR-122a в энтероцитах, культивируемых клетках и тканях кишечника и тем самым вызывать деградацию мРНК окклюдина и повышать проницаемость кишечника [11]. Напротив, зонулин может быть индикатором кишечного барьера, который был первоначально обнаружен в 2000 году как мишень для токсина zonula occludens [12]. Наше предыдущее исследование показало, что частота инфекций после периоперационного лечения пробиотиками была ниже, чем в контрольной группе [12]. Пробиотики могут снижать уровень сывороточного зонулина, продолжительность послеоперационной лихорадки, продолжительность антибактериальной терапии и частоту послеоперационных инфекционных осложнений [12]. Наше настоящее исследование было направлено на изучение механизма молекулярной регуляции миР-122a уровня экспрессии зонулина для лечения дисфункции кишечного барьера. Было показано, что ЛПС является фактором повреждения кишечного барьера [27], и мы впервые проверили влияние ЛПС на уровень экспрессии зонулина и миР-122а. Результаты показали, что уровни экспрессии miR-122a и зонулина были повышены после обработки LPS. Однако уровень экспрессии EGFR снижался только на уровне экспрессии белка, а не на уровне мРНК, определенном с помощью qRT-PCR, из-за посттранскрипторной регуляции EGFR, например, регулируемой miR-122a. Мыши MiR-122a-TG и первичная культура клеток кишечника могут дополнительно подтвердить регуляторные эффекты miR-122a на экспрессию EGFR. МиР-122а также может быть регулятором кишечного барьера.

Анализ люциферазы подтвердил, что EGFR является мишенью miR-122a. Трансфекция miR-122a в клетки Caco-2 приводила к снижению экспрессии EGFR только на уровне белка, определяемом вестерн-блоттингом, который ингибировался на посттранскрипторном уровне, тогда как мРНК EGFR не затрагивалась, как регуляторный механизм микроРНК [1, 15, 28]. Совместная транскрипция EGFR с миР-122а может перекрывать эффекты миР-122а на повышенный уровень экспрессии зонулина, возможно, потому, что повышенный уровень EGFR поддерживает ингибирование молекулярной регуляции экспрессии зонулина. Наоборот, miR-122a может проявлять свои эффекты путем ингибирования транскрипции EGFR.

Проницаемость кишечника увеличивалась после сверхэкспрессии miR-122a и в группе miR-122a-TG, что соответствовало уровню зонулина, и это увеличение могло быть показателем кишечной проницаемости, как сообщалось [12]. Воспалительные цитокины IL-6 и TNF-α также были параллельны уровню экспрессии miR-122a. Таким образом, мы пришли к выводу, что LPS может стимулировать экспрессию miR-122a и, следовательно, ингибировать посттранскрипторную экспрессию EGFR, повышать экспрессию и способствовать кишечной проницаемости и воспалению кишечника (LPS-miR122a-EGFR-зонулин-кишечная проницаемость-воспаление). Мы предположили, что LPS может вызывать дисфункцию кишечного барьера через путь miR-122a.

В молекулярном механизме miR-122a miR-122 регулирует синтез белка CAT-1; мРНК нацелена на Р-тела, которые могут быть разгружены белком HuR, высвобождаемым из ядра в условиях стресса [29]; Взаимодействие HuR приводит к высвобождению мРНК из P-телец [29]. Многочисленные другие мишени, такие как CD320, AldoA и BCKDK, также были идентифицированы с помощью микрочипа изменений в печени мышей, получавших ингибиторы miR-122 [30-32]. Другие сообщения показали, что miR-122 также может регулировать системный гомеостаз железа с помощью Hjv и Hfe [33], тогда как ингибирование miR-122 у мышей или приматов не приводит к какой-либо обнаруживаемой токсичности для печени [34]. Молекулярный механизм miR-122a, особенно для зонулина, не описан. В нашем исследовании изучался молекулярный механизм miR-122a на экспрессию зонулина через путь EGFR, который является рецептором клеточной поверхности для членов семейства внеклеточных белковых лигандов эпидермального фактора роста [35]. Большинство исследований miR-122a были сосредоточены на гепатоцеллюлярной карциноме [36], которая может снижать онкогенные свойства в клеточных линиях ГЦК, и она действует как ген-супрессор опухоли и увеличивает ответ на химиотерапевтические препараты сорафениб [37]. Было идентифицировано несколько генов-мишеней miR-122, включая ADAM10, IGF1R, CCNG1 и ADAM17 [37, 38]. Следовательно, другие пути передачи сигнала также нуждаются в дальнейшем изучении. В нашем исследовании мы в основном обращали внимание на путь EGFR, который мог регулироваться miR-122a, что приводило к чередованию зонулина. Молекулярная мишень, такая как miR-122a, EGFR и зонулин, может быть использована в качестве потенциальных терапевтических мишеней.

Наше исследование может быть ограничено недостаточными исследованиями связи между зонулином и белками, связанными с плотными контактами. Дальнейшие тесты могут быть необходимы для наших будущих исследований.

Заключение

miR-122a может действовать как позитивный фактор зонулина путем нацеливания на EGFR, который повышает проницаемость эпителия кишечника in vivo и in vitro .

Благодарности

Эта работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81370480, 81670480), Учебной программы Плана крупных исследований Фонда естественных наук провинции Гуандун (2014A030308004) и талантов высокого уровня в провинции Гуандун. Специальный план поддержки провинции — Молодежные таланты в области науки и техники (2015TQ01R334).

Заявление о раскрытии информации

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4. 0 International License (CC BY-NC-ND). Использование и распространение в коммерческих целях, а также любое распространение измененного материала требует письменного разрешения. Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством. Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам.