ДЗ-122 () (ДЗ-122, ДЗ-122А)- описание, характеристики, история.
Автогрейдер предназначен для:
— Производство планировочных работ при строительстве насыпей и выемок земельного полотна автомобильных и железнодорожных дорог;
— планеровка площадей и поверхностей;
— устройство корыта для слоев дорожной одежды;
— смешивание грунтов с добавками органических и минеральных вяжущих материалов на полотне дороге;
— ремонт и содержание дорог и обочин;
— очистка дорог от снега;
ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
| Муфта сцепления | Двухдисковая, постоянно замкнутая |
|---|---|
| Коробка передач | Гидромеханическая |
| Задний мост:главная передача | Двухступенчатая |
| Тормоза рабочие | Колодочные на все ведущие колеса, двухконтурные гидроуправляемые, с гидроусилителем |
| Тормоз стояночный | Колодочный, с гидравлическим управлением |
| Управление рабочими органами | Гидравлическое / механическое |
| Рулевое управление | Гидростатическое |
| Управление муфтой сцепления | Механическое с гидроусилителем |
| Тип ходовой части | С пневматическими колесами |
| Колесная схема | 1-2-3 |
| Размер шин, дюйм | 14-20 |
| Количество шин | 6 |
| Тип рамы | Шарнирно-сочлененная |
| Угол складирования рамы в обе стороны, град | До 30 |
| Смещение колес переднего моста относительно заднего, мм | До 2000 |
| Скорость движения, км/ч: | |
| — вперед | I — до 7,4; II — до 13,4; III — до 25,4; IV — до 43,0 |
| — назад | I — до 7,7; II — до 25,2 |
| Длина, мм | 10150 |
| Ширина, мм | 2500 |
| Высота, мм | 3550 |
| Масса эксплуатационная, кг | 14600 |
Рабочее оборудование:
Грейдерный отвал: основной рабочий орган автогрейдера, который имеет универсальную установку в пространстве для производства работ, специфичных для автогрейдера.
- длина, мм: 3744
- высота (по хорде), мм: 632
- угол резания, град: до 30–70
- угол срезаемого откоса, град: до 90
- боковой вынос отвала в обе стороны, мм: до 800
Бульдозерный отвал: бульдозер автогрейдера используется для продольного перемещения грунта и других дорожно-строительных материалов, на отсыпке небольших насыпей, на засыпке небольших ям или котлованов и траншей, а также на других работах, связанных с планировкой. В зимнее время бульдозер может быть эффективно использован на очистке снега.
- длина, мм: 2527
- высота, мм: 860
Кирковщик: кирковщик предназначен для вскрытия плотных грунтов, изношенного полотна дороги, скалывания льда и прочих работах связанных с изменением плотности дорожно-строительных материалов.
- ширина киркования, мм: 1318
- глубина киркования, мм: 260
- число зубьев: 3
Технические характеристики грейдера ДЗ 122, автогрейдера дз-122, avto greider dz
Главная ⇒ Грейдер ДЗ / ГС⇒ Грейдер / автогрейдер ДЗ 122А⇒ Технические характеристики грейдера
- Грейдер ДЗ 122 А — завод изготовитель «Дормаш», предназначен для выполнения планирования земляного полотна дороги, возведения насыпных сооружений, планирование площадей, устройству дороги так называемому корыто, а также для смешивания грунтов с добавками и вяжущими материалами на полотне дороги.
Его используют для ремонта и содержания дорог и обочин, очистки снега, рыхления асфальтовых покрытий, булыжных мостовых и тяжелых грунтов. Может работать на грунтах I — III категории. Температурный режим эксплуатации окружающей среды -40°С…+40°С в условиях умеренного и тропического климата. - Грейдер ДЗ 122 А и его модификации по конструкции аналогичны модели ДЗ 143 Брянского производства и имеют много унифицированных узлов.
- Грейдер ДЗ 122 А оснащен двигателями А-01МС с электростартером или А-01М с пусковым двигателем, с электростартером. На автогрейдере ДЗ 122А установлен мощный рыхлитель-кирковщик, расположенный сзади.
- ДЗ-122 применяют 3-и вида коробок передач: Гидромеханической (ГМКП) с 4-мя передачами вперед и 2-мя назад. Механической с 6-ю передачами вперед и передаточным числом на повышеной передаче равной (i = 0,62), и 2-мя передачами назад. Механической (МКПП)с 6-ю передачами вперед и передаточным числом на повышеной передаче равной (i = 0,835) и 2-мя передачами назад.
- Автогрейдер ДЗ-122А в настоящее время снят с производства и не выпускается. Запчасти на, грейдер есть у нас.
Его используют для ремонта и содержания дорог и обочин, очистки снега, рыхления асфальтовых покрытий, булыжных мостовых и тяжелых грунтов. Может работать на грунтах I — III категории. Температурный режим эксплуатации окружающей среды -40°С…+40°С в условиях умеренного и тропического климата.
Основные части автогрейдера производства Орел. Скелет конструкции базируется на раме. Она бывает двух видов: цельная и сочлененная рама основная. Цельная уже изначально само название говорит о том, что рама имеет жесткую конструкцию в отличии от сочлененный. Хотя у сочлененной рамы ряд своих преимуществ. Учитывая габариты грейдера, эта рама позволяет грейдеру делать меньший круг поворота и производить планировку дорог с меньшими нагрузками на кузов машины. Не малую роль в этой работе занимает кронштейн самолет дз-122А.01.04.000. К нему крепятся гидроцилиндры для подъема и выноса тяговой рамы. На автогрейдере ДЗ 122 используются 8 гидроцилиндров и у каждого свое назначение. Следующий элемент машины Бульдозер-кирковщик ДЗ-122А.30.00.000. Он состоит из рамы рыхлителя, кирки, отвала и других более мелких деталей.
19.00.000-01. Как и отвал, кирковщик имеет быстросменные расходные матерьялы, так называемые зубья. Для ДЗ-122 их маркировка кирка – зуб в сборе ДЗ-122.30.00.002. Они изготавливаются из высокопрочной стали. Механизм приведения в рабочее состояние осуществляется при помощи все тех же гидроцилиндров. На Орловском используется гидроцилиндр подъема рыхлителя ДЗ-122Б.08.05.000-02. Автогрейдер ДЗ 122 базируется на двух мостах, мост передний и мост задний. Мост передний ДЗ-122А, ДЗ-122А.03.00.000, состоит из балки, на которую устанавливаются оси, шатуны, тяги, наконечники и т.д. В данном узле основную нагрузку получают подшипники и кулак поворота. Имеет место выходить из строя и 
На мосту установлены два вида гидроцилиндров. Гидроцилиндр рулевого управления левый ДЗ-122.06.30.000-01 и правый ДЗ-122.06.30.000-03, с их помощью грейдер производит поворот машины по ходу своего движения вправо либо влево. Второй вид цилиндров — Гидроцилиндр наклона колес ДЗ-122А.03.25.000 позволяет автогрейдеру совершать меньший круг поворота, т.к. они наклоняют колеса в сторону поворота машины. Задний мост или Тележка задняя ДЗ-122А.04.00.000 состоит из редуктора, балансиров, тормозов колесных и ручного. На Орловском автогрейдере ДЗ 122 это основной ведущий мост в отличии от Брянского ДЗ-180 полно приводного, там ведущие мосты оба передний и задний. На Орловском, задней тележке установлен редуктор заднего моста ДЗ 122 А / Б, который состоит из корпуса, подшипников, чулок, фланцев, шестерен, валов и хвостовика. Он передает крутящий момент от коробки передач через хвостовик на ведомую шестерню, а та в свою очередь на шестерни балансиров.
Балансир ДЗ 122, ДЗ 122.04.06.000 каталожный номер, состоит из группы шестерен получающих крутящий момент от редуктора и передающий его на колеса. Наиболее изнашиваемая деталь в балансире – шестерня паразитная или паразитка. На балансире установлен тормоз колесный ДЗ 122, каталог ДЗ 122.04.09.000 и тормоз ручной ДЗ 122 ДЗ-31-2.04.07.000
Один гидроцилиндр подъема тяговой рамы ДЗ-122.08.06.000 производит ее подъем, другой гидроцилиндр выноса тяговой рамы ДЗ-122.08.06.000-01 делает вынос. Механизм привода оборудования – это редуктор поворота ДЗ 122 А / Б, есть отличительные особенности в нем. Разница между редуктором А и Б в расстоянии шпилек вокруг отверстия тяговой рамы. Весь механизм приводит в нужное положение отвал ДЗ-122 (лопата). Как и передний отвал производит туже работу, но при помощи рабочего оборудования он более управляем. помимо горизонтального угла резания имеет возможность и при выносе обрабатывать вертикальную поверхность. Также как и на передний отвал устанавливаются ножи. Угол резания изменяется гидроцилиндром. Гидроцилиндр угла резания ДЗ-122.08.06.000-01. Вынос отвала для работ при вертикальной обработки поверхности производится другим гидроцилиндром. Гидроцилиндр выноса отвала ДЗ-122.
08.12.000.
Общие данные
| Класс | 122А |
| Длина (при поднятом бульдозере с запасным колесом), мм | 2 500 |
| Ширина (по шпилькам колеса), мм | 3 250 |
| Высота без проблескового маяка, мм | А-01МС / А-01М |
| Высота c проблесковым маяком, мм | 3 500 |
| База (расстояние между осью переднего моста и осью балансирной тележки), мм) |
5 830 |
| База заднего моста (между осями колес), мм | 1 440 |
| Колея передний и задних колес, мм | 2 000 |
Ходовая часть
| Тип | пневмоколесный |
| Число шин | 6 |
| Размер шин | 14,00-20,00 |
| Колесная схема | 1х2х3 |
| Эксплуатационная масса, кг | 14 373 |
Управление грейдером
| Управление рабочими органами | гидравлическое |
| Рулевое управление | гидростатистическое |
| Управление муфтой сцепления | механическое с гидроусилителем |
Двигатель
| Модель | А-01МС (дизель) |
| Полная мощность по SAE, КвТ | 99 |
| Частота вращения коленчатого вала при полной номинальной мощности, C-1 |
28,3 |
Тормоза
| Ножные тормоза | колодочные на все ведущие колеса |
| Стояночный тормоз | колодочный |
Трансмиссия
| Муфта сцепления | двухдисковая, постоянно замкнутая |
| Коробка перемены передач | У35. 606-32 (гидромеханическая) |
Задний мост
| Главная передача | механический двухступенчатый редуктор |
| Бортовые передачи | шестеренные редукторы |
Расчетные скорости (без учета буксирования колес при номинальной частоте вращения вала и радиуса колес 555мм) км/ч — вперед
| 1 передача | 7,4 |
| 2 передача | 13,4 |
| 3 передача | 24,5 |
| 4 передача | 43,0 |
Расчетные скорости (без учета буксирования колес при номинальной частоте вращения вала и радиуса колес 555мм) км/ч — назад
| 1 передача | 7,7 |
| 2 передача | 25,2 |
Рабочее оборудование
| Отвал | полноповоротный |
| Длина, мм | 3 724 |
| Высота с ножами по хорде, мм | 620 |
Урол резания, град. |
30-70 |
| Урол срезаемого откоса, град. | до 90 |
| Боковой вынос отвала в обе стороны относительно тяговой рамы, мм |
800 |
| дорожный просвет под отвалом в транспортном оложении, мм, не менее |
350 |
| Заглубления, мм, не менее | 250 |
Бульдозерный отвал
| Длина, мм | 2 475 |
| Высота с ножами по хорде, мм | 840 |
| Урол резания, град. | 70 |
| Заглубления, мм, не менее | 50 |
Криковщик
| Ширина киркования, мм | 1 490 |
| Заглубление киркования, мм, не менее | 250 |
| Число зубьев | 4 |
Электрооборудование
| Схема электрооборудования | постоянный ток, однопроводная, (минус) соединен с массой |
| Номинальное напряжения в сети, В | 12 (цепь стартера 24В) |
| Число зубьев | 4 |
Производитель
| Предприятие изготовитель | выпускался ЗАО «Дормаш» |
Компания ООО «ТД «СПЕЦЗАПЧАСТЬ» занимается поставкой запасных частей для дорожно-строительной и коммунальной техники.
Основное направлением нашей компании — это поставка запчастей на грейдера ДЗ 122, 143, 180, ГС-14.02. Запчасти в наличии на складе. Наша компания является крупным поставщиком запчастей для грейдеров ДЗ 122, 143, 180, ГС 14.02, и др. техники. Мы предлагаем по настоящему качественные запчасти, по действительно низким ценам. На сайте Вы можете ознакомиться заказать перечень основных запчастей и узлов, устанавливаемых на дорожную, коммунальную и строительную технику. Подробную информацию о поставке, запчастей на грейдер дз, Вы можете получить связавшись с нами по электронной почте или позвонив по телефону. Мы поставляем запчасти по всей территории РФ и ближнему зарубежью. Отгрузка запчастей осуществляется транспортными компаниями Байкал-Сервис, Автотрейдинг, Грузовозофф.
ООО «ТД «СПЕЦЗАПЧАСТЬ» — запчасти на грейдер, дорожно-строительную и коммунальную технику, гидрораспределители и гидроцилиндры.
Советская технология строительной техники – vulcanhammer.
infoАвтор Don Warrington, размещено в рубрике Компания
На этом сайте я разместил несколько статей о советской (а затем и российской) сваебойной технике, такой как дизельные молоты , сваебойные бетономешалки, вибрационные и ударно-вибрационные молоты. Это очень специализированные темы даже по стандартам строительной отрасли; здесь я хочу представить несколько фотографий, представляющих более общий интерес для вас, любителей тяжелой техники. Советский Союз был известен своей приверженностью тяжелому производству и строительному оборудованию, и это, безусловно, большая часть этого.
НПО ВНИИстройдормаш — советское название московского института, который спроектировал и испытал показанное ниже оборудование. Название означает Всесоюзный научно-исследовательский институт строительных и дорожно-строительных машин. Он был создан в 1975 году и просуществовал после распада Советского Союза в 1991 году как акционерное общество, то есть приватизированная корпорация.
В дополнение к оборудованию для забивки свай, которое привлекло меня к организации, оно разработало много других типов оборудования, и лучший способ показать это следует из их каталога, произведенного около 1986.
Для увеличения эффективного противовеса на нем установлены выносные опоры. Экскаватор ЭО-3323 также установлен на колесах с выносными опорами. Красный ковш на конце имеет вместимость 0,75 м3. Что касается кранов, то это 12,5-тонный гидравлический автокран. Очень полезны для подъема легких грузов, они довольно распространены на строительных площадках и в других местах. 40-тонный автокран, еще один универсальный инструмент.Наше предприятие часто использовало их для сборки больших молотов, но иногда что-то шло не по плану.
250-тонный кран. Для действительно тяжелых подъемов Vulcan мог бы использовать это для своих самых больших продуктов. Подобные краны использовались в начале 1980-х годов для модификации самого большого молота. Вибрационный каток DM-476 для уплотнения. Эти машины предназначены не для глубокого уплотнения грунтов, а для выравнивания поверхности, что необходимо при строительстве дорог и аэродромов. Автогрейдер ДЗ-140, используемый для окончательной планировки дорог перед выравниванием и мощением.
Длина отвала 4,8 м. Погрузчик с бортовым поворотом ТО-31, более известный на американских рабочих площадках как «Бобкэт» в честь популярного американского бренда. Может, надо было назвать это «Сибирский тигр». Бульдозер-рыхлитель. Большинство людей связывают бульдозеры с движущейся землей, но этот предназначен для разрушения породы для удаления. Компьютерный дизайн, 19Стиль 80-х: Компьютерный зал ВНИИстройдормаш. Библиотека ВНИИстройдормаш. Женская лыжная команда ВНИИстройдормаш.Вулкан впервые связался с Институтом в 1988 году, и наши контакты продолжались следующие шесть лет. Иногда все становилось странным, но мы обнаружили организацию, которая выпускала очень хорошие проекты строительного оборудования. К сожалению, советская производственная организация не была на должном уровне контроля качества, особенно в гражданском секторе, и эта слабость была одной из тех, которые в конечном итоге привели Советский Союз к краху.
Нравится:
Нравится Загрузка…
МикроРНК-122a регулирует зонулин путем нацеливания на EGFR при дисфункции эпителия кишечника — полный текст — клеточная физиология и биохимия, 2017, том.
42, No. 2 Предпосылки/Цели: Это исследование было направлено на изучение роли микроРНК (миР)-122a в регуляции зонулина во время модуляции кишечного барьера. Методы: Белки зонулина и экспрессия их генов-мишеней анализировали в клеточных линиях, сверхэкспрессирующих miR-122a, и в гене-мишени рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Модель mmu-miR-122a кишечного эпителия условно трансгенных (miR-122a-TG) мышей была создана для исследования экспрессии EGFR и зонулина. МиР-122а также была обнаружена в клинических образцах воспалительного заболевания кишечника. Результаты: EGFR был идентифицирован как ген-мишень miR-122a. Уровень экспрессии miR-122a положительно коррелировал с уровнем зонулина. Уровень экспрессии зонулина был значительно повышен, тогда как уровень экспрессии EGFR был значительно снижен у мышей miR-122a-TG и в соответствующей первичной культуре эпителия (P <0,05). Эти результаты согласуются с данными клинических образцов.
Выводы: miR-122a может быть положительным фактором зонулина путем нацеливания на EGFR, что увеличивает проницаемость эпителия кишечника in vivo и in vitro .
Введение
МикроРНК (миРНК, миР) действуют как негативные регуляторы трансляции генов посредством ингибирования трансляции мРНК или стимулирования деградации мРНК путем связывания с их 3′-нетранслируемыми областями (3′-НТО) [1]. МикроРНК могут участвовать в регуляции экспрессии генов в различных критических биологических процессах, таких как развитие, дифференцировка, апоптоз и пролиферация [2]. Изменения экспрессии микроРНК также связаны со многими заболеваниями, включая рак [3-5], болезни сердца [2]. 6], расстройства нервной системы и нарушение функции кишечного барьера [1, 7, 8].
Связь между микроРНК и дисфункцией эпителиального барьера кишечника редко исследовалась [1, 7-11]. МакКенна и др. определили полный профиль экспрессии микроРНК в слизистой оболочке кишечника млекопитающих и вклад микроРНК в гомеостаз кишечника с использованием мутантных мышей Dicer1 loxP/loxP : Villin-Cre и обнаружили снижение экспрессии всех микроРНК [11].
Барьерная функция кишечника у мышей с дефицитом Dicer1 нарушена, что вызывает воспаление кишечника с инфильтрацией лимфоцитами и нейтрофилами. Фактор некроза опухоли альфа (TNF)-α может быстро повышать экспрессию miR-122a в энтероцитах, культивируемых клетках и тканях кишечника и, следовательно, индуцировать деградацию мРНК окклюдина и повышать проницаемость кишечника [11]. Зонулин представляет собой белок, обнаруживаемый в плотных соединениях кишечного тракта и секретируемый возбудителем холеры 9.0024 Vibrio cholerae , который был первоначально обнаружен в 2000 году как мишень для токсина zonula occludens [12]. Зонулин также является индикатором кишечной проницаемости [12, 13].
Также была изучена взаимосвязь между miR-122a и уровнями экспрессии зонулина. Мы предположили, что miR-122a может помочь защитить функции кишечного барьера, регулируя зонулин. Мы стремились исследовать молекулярные механизмы miR-122a в регуляции зонулина путем нацеливания на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR).
Материалы и методы
Клеточная культура
Клетки Caco-2, приобретенные в ATCC (Манассас, Вирджиния), выращивали в стандартных условиях культивирования клеток и выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО 2 . Клетки пассировали при плотности предварительного слияния с использованием 0,05% трипина и 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (Gibco, США), как описано ранее. Для разных групп добавляли 5 мкг/мл липополисахарида (ЛПС) (24 ч) с диметилсульфоксидом (ДМСО) (48 ч) для лечебной группы, тогда как фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (24 ч) с ДМСО (48 ч). h) был добавлен для контрольной группы.
Трансфекция лентивируса со сверхэкспрессией miR-122a
кДНК hsa-miR-122a амплифицировали с помощью RT-PCR с геномной ДНК человека с использованием 5′-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT-3′ и 3′-ACCTCACACTCTTACCACAAAACA-5′.
5′- и 3′-праймеры содержали сайты BamHI и XhoI, соответственно, как показано подчеркиванием. Амплифицированную кДНК встраивали в сайты BamHI и Xho I экспрессионного плазмидного вектора млекопитающих, PGIP2 (Promega), в сайт ниже промотора цитомегаловируса. Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали с помощью набора плазмид Qiagen (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) и использовали для трансфекции клеток NCM460. Ориентацию вставки подтверждали секвенированием. После проведения трансфекции с использованием реагента Tfx-50 (Promega) клетки культивировали в присутствии G418 и через 2 недели собирали устойчивые к G418 колонии. Клеточные клоны размножали индивидуально, и клоны, экспрессирующие высокие уровни hsa-miR-122a на своей поверхности, отбирали с помощью проточного цитометрического анализа с SN2Ab. В этом исследовании использовали клон (обозначенный как h21-SN2), который экспрессировал hsa-miR-122a на клеточной поверхности на том же уровне, что и клетки NCM460 [14].
Создание и идентификация трансгенных мышей miR-122a
Интестинальные трансгенные мыши miR-122a (mir-122a-TG) были созданы Cyagen Biosciences Inc.
(Гуанчжоу, Китай) с использованием промотора виллина и фоновых мышей C57BL/6, как описано [15]. Мышей разводили и содержали в Центре лабораторных животных Университета Сунь Ятсена (Гуанчжоу, Китай). Всех мышей выращивали в особых условиях, свободных от патогенов, с фильтрованным воздухом, кормили кормом для грызунов вволю и давали свободный доступ к воде. Генотипирование мышей проводили методом ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из хвоста с помощью набора для выделения тканевой ДНК (Biomiga, Китай). Исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Сунь Ятсена. Мышей умерщвляли в возрасте 8 недель для определения. Концентрацию зонулина в сыворотке через 24 часа после операции измеряли с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), как описано ранее [12].
Выделение кишечного эпителия и первичной культуры клеток толстой кишки
Проксимальный и дистальный отделы слепой кишки и толстой кишки вскрывали вдоль их вертикальной оси и содержимое их просвета удаляли путем промывания тканей в PBS.
Каждый сегмент помещали в забуференный физиологический раствор Хэнкса (HBSS), содержащий 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты и 1% телячьей сыворотки (Sigma) (три промывки по 5 мин каждая, 20 мл/промывка). . РНК выделяли (набор RNeasy, Qiagen) из осадка клеток (эпителиальная фракция) и оставшихся фрагментов ткани (мезенхимальная фракция) [16]. Первичную культуру клеток mir-122a-TG толстой кишки проводили, как описано [17].
Пациенты
Ткани толстой кишки были получены из хирургических образцов пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), поступивших на операцию. Образцы крови собирали и хранили надлежащим образом. Клиническое исследование было одобрено этическим комитетом Шестой дочерней больницы Университета Сунь Ятсена и Пятой дочерней больницы Медицинского университета Гуанчжоу. От пациентов были получены информированные согласия.
Анализ люциферазы
Полученные фрагменты, содержащие интактные предполагаемые последовательности распознавания miR-122a из 3′-UTR или со случайными мутациями, были клонированы в векторе psi-CHECK2 (Promega), как описано ранее.
Клетки Caco-2 котрансфицировали с использованием Transit-TKO (Invitrogen) с репортерными плазмидами и вектором дикого типа (WT) или мутантным вектором. Анализы люциферазы проводили через 48 ч после трансфекции в соответствии с протоколом производителя (репортерная система анализа двойной люциферазы, E19).10; Промега). Активность люциферазы измеряли с помощью системы отчетов Dual-Luciferase (Promega).
Выделение РНК
Суммарную РНК выделяли из образцов клеток или тканей с использованием лизирующего буфера Trizol (Ambion, США) согласно инструкции производителя. Выделение микроРНК из образцов клеток, тканей или сыворотки проводили с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Синтез первой цепи кДНК проводили с помощью набора для обратной транскрипции (Invitrogen, США). qRT-PCR для мРНК проводили с использованием SYBR Master Mix (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием системы 7500 Real-Time PCR.
Синтез первой цепи кДНК также проводили с помощью набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (ABI, США). qRT-PCR для микроРНК проводили с использованием TaqMan microRNA Assay (ABI, США). Последовательности праймеров для qRT-PCR были следующими:
EGFR: (F) 5′-ATGGTCAAGTGCTGGATG-3′, (R) 5′-GAGGAAGGTGTCGTCTATG-3′ Зонулин: (F) 5′-TCATCACGGCGCGCCAGG-3′, (R) 5′-GGAGGTCTAGAATCTGCCCGAT-3′ Интерлейкин ( IL)-6: (F) 5′-CCAGAAGACCAGAGGAAA-3′, (R) 5′-GGAAATCGTGGAAATGAG-3′ TNF-α: (F) 5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′, (R) 5′-TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG-3 ‘ Окклюдин: (F) 5′-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3′; (R) 5′-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3′ CLDN-1: (F) 5′-CTTCAGCAGACGAAGGTT-3′, (R) 5′-CATAGGCAGGACAAGAGTTA-3’.
Вестерн-блот-анализ
Для вестерн-блоттинга белки разделяли на гелях для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а затем переносили на поливинилидендифторидные мембраны (Millipore, Massachusetts) с использованием мокрого электроблоттинга (Bio-Rad) в течение 120 мин при 100 В.
Затем мембрану инкубировали с соответствующим первичным антителом при 4°C в течение ночи, трижды (каждый раз по 10 мин) промывали трис-буферным солевым раствором (TBS), содержащим 0,1% Tween 20 (TBS-T буфер), а затем инкубировали в течение 1 ч с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, в буфере TBS-T в течение 4 ч при 4°C. Мембрану трижды (по 60 мин) промывали буфером TBS-T и проявляли методом усиленной хемилюминесценции (набор ECL; Pierce, Illinois) согласно инструкции производителя [12]. В нашем исследовании использовались антитела к окклюдину (EPR8208, ab167161), антитела к клаудину 1 (EPRR18871, ab211737), антитела к EGFR (EP38Y, ab5289).4) и антитело против гаптоглобина (HG-36, ab13429).
Анализ проницаемости
Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TER) и проницаемости для декстрана было описано ранее [18]. Монослои кишечного эпителия были разделены на пять различных экспериментальных групп в трех повторностях.
Измерение кишечной проницаемости и повреждения толстой кишки у мышей проводили, как описано ранее [18]. Окончательные данные представляли либо как фракционную экскрецию (для сукралозы) для определения проницаемости толстой кишки, либо как соотношение фракционной экскреции (для лактулозы/маннита) для количественной оценки проницаемости тонкой кишки. Фракционная экскреция определялась как доля введенной через зонд дозы, выводимой с мочой, а отношение фракционной экскреции определялось как отношение доли введенной через зонд дозы лактулозы, выведенной с мочой, к доле введенной через зонд дозы маннита, выведенной с мочой. в моче. Анализ камеры с использованием также использовали для определения измерения кишечной проницаемости в изолированных толстых кишках мышей. Ионное сопротивление ткани (1/G, где G — проводимость) рассчитывали по разности потенциалов и току короткого замыкания по закону Ома [18].
Статистический анализ
Данные были подвергнуты статистическому анализу в GraphPad Prism 5 (Сан-Диего, Калифорния) и выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.
Статистический анализ проводили с помощью парного критерия Стьюдента t . P <0,05 был определен как значимый.
Результаты
ЛПС оказывает повреждающее действие на плотные соединения
После введения ЛПС уровни экспрессии клаудина-1 и окклюдина значительно снижались в клетках Caco-2 (рис. 1 A и B, P <0,05), тогда как уровни экспрессии miR-122a и зонулина были повышены (рис. 1 C&D, P <0,05). Для уровня экспрессии EGFR ПЦР показала незначительное изменение (рис. 1 E, P> 0,05), тогда как Вестерн-блот показало значительное снижение (рис. 1 F, P <0,05), что может указывать на посттранскриптную регуляцию EGFR. , такие как миР-122a-индуцированная регуляция.
Рис. 1.
ЛПС имел примесь к плотному соединению кишечника. (A) LPS может снизить уровень экспрессии окклюзии и клаудина-1, определяемый с помощью qRT-PCR. (B) ЛПС может снизить уровень экспрессии окклюзии и клаудина-1, определяемый вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. (C) LPS может повысить уровень экспрессии миР-122a, определенный с помощью qRT-PCR.
(D) ЛПС может повышать уровень экспрессии зонулина, определенный с помощью qRT-PCR. (E) LPS не мог снизить уровень экспрессии мРНК EGFR, определенный с помощью qRT-PCR. (F) ЛПС может снижать уровень экспрессии белка EGFR, определенный вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. * Р < 0,05. Было проведено три независимых эксперимента.
Прогнозирование EGFR как мишени miR-122a
Сайт связывания miR-122a-мишени был предсказан с использованием трех различных вычислительных программ: TargetScan (http://www.targetscan.org/) [19], PicTar (http:/ /pictar.bio.nyu.edu.), [20] и miRanda (http://www.microrna.org/) [21]. После того, как три списка были сгенерированы тремя вычислительными программами, был сгенерирован четвертый список, который содержал гены, предсказанные всеми тремя исходными вычислительными программами (табл. 1). При анализе биоинформатики MetaCore TM , мы выбрали EGFR в качестве кандидата с наивысшим баллом (таблица 1), который, как сообщается, может ослаблять воспаление кишечника у мышей [22].
Таблица 1.
Биоинформатический анализ оценки гена-мишени микроРНК-21
Мы сконструировали векторы 3’UTR мРНК EGFR (WT и мутантные) и вставили их непосредственно ниже репортерного гена люциферазы, чтобы определить, является ли EGFR регулируется miR-122a посредством прямого связывания ее 3′-UTR. В анализах люциферазы предшественник miR-122a или контроль совместно трансфицировали в клетки Caco-2 с различными векторами люциферазы 3′-UTR. МиР-122a значительно снижала относительную активность люциферазы в 3’UTR WT EGFR (P <0,05, рис. 2F). Напротив, относительная активность люциферазы существенно не снижалась в UTR с сайтами связывания мутантов.
Рис. 2.
EGFR может быть геном-мишенью miR-122a. (A) Сверхэкспрессия миР-122a увеличивала уровень экспрессии зонулина, в то время как не указывала на изменение EGFR, определенное с помощью qRT-PCR (B). (C) Сверхэкспрессия miR-122a повышала уровень экспрессии зонулина и EGFR, определяемый вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом.
(D, E) Совместная сверхэкспрессия miR-122a и EGFR продемонстрировала аналогичные эффекты на экспрессию зонулина по сравнению с единичной сверхэкспрессией EGFR, которая охватывала эффекты miR-122a как на уровне экспрессии мРНК, так и на уровне белка, определяемом с помощью qRT- ПЦР, вестерн-блоттинг и полуколичественный анализ, тогда как только сверхэкспрессия мутантной формы miR-122a не указывала на разницу с контролем. (F) Анализ люциферазы показал, что мишенью miR-122a может быть 3′-UTR EGFR. * Р < 0,05. ** против *, Р > 0,05. Было проведено три независимых эксперимента.
qRT-PCR и вестерн-блоттинг показали, что miR-122a может снижать уровень экспрессии зонулина в клеточной линии Caco-2, трансфицированной предшественником miR-122a (рис. 2 A и C, P <0,05). Однако уровень экспрессии EGFR был значительно снижен только на уровне белка с помощью вестерн-блоттинга, а не на уровне мРНК, обнаруженном с помощью qRT-PCR (рис. 2 B и C, P <0,05). Совместная трансфекция miR-122a и EGFR в клетки Caco-2, приводящая к снижению экспрессии зонулина, сходному с однократной трансфекцией EGFR, указывает на то, что miR-122a может оказывать EGFR-зависимое действие на экспрессию зонулина (рис.
2 D&E, P <0,05). ). Однако сверхэкспрессия мутантной формы miR-122a не имела существенных отличий от контроля (рис. 2D, P> 0,05).
Уровень экспрессии miR-122a коррелировал с уровнем экспрессии зонулина
Эксперименты in vivo также проводились на мышах miR-122a-TG для определения влияния miR-122a на кишечный барьер. Ткани толстой кишки были выполнены для qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Уровень экспрессии зонулина был более значительно повышен у мышей miR-122a-TG, чем в группе WT, что было обнаружено с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга, что согласуется с результатами в клеточной линии Caco-2, как сообщалось выше (рис. 3A и C). . Напротив, уровень экспрессии EGFR был снижен более значительно у мышей miR-122a-TG, чем в группе WT, обнаруженной только вестерн-блоттингом (рис. 3B и C). Аналогичные результаты были получены для первичной клеточной культуры эпителия miR-122a-TG (MCE-TG, рис. 3 D-F).
Рис. 3.
МиР-122а кишечные трансгенные мыши получили более высокий уровень экспрессии зонулина.
(A) Мыши MiR-122a-GT имели повышенный уровень экспрессии зонулина в кишечнике, определенный с помощью qRT-PCR. (B) У мышей MiR-122a-GT не было сниженного уровня экспрессии EGFR в кишечнике, определенного с помощью qRT-PCR. (C) Мыши MiR-122a-GT имели более высокий уровень экспрессии зонулина и сниженный уровень кишечной экспрессии EGFR, определенный вестерн-блоттингом и полуколичественным анализом. (D, E, F) Первичная культура клеток показала аналогичные результаты. * Р < 0,05. Было проведено десять независимых экспериментов.
MiR-122a усиливала проницаемость кишечника и воспаление in vitro и in vivo
Масса тела мышей miR-122a-TG была значительно меньше, чем у контрольной группы через 8 и 12 недель. (P <0,05, рис. 5A). Наблюдалась высокая смертность мышей miR-122a-TG. TER был значительно ниже после трансфекции miR-122a в клетки Caco-2, тогда как относительная интенсивность была значительно выше (P <0,05, рис. 4A). Использование камерного анализа и фракционной экскреции (для лактулозы/маннита) также показало более высокую проницаемость мышей miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой WT.
Анализы qRT-PCR показали, что экспрессия IL-6 и TNF-α на уровнях мРНК в сыворотке значительно увеличилась у мышей miR-122a-TG по сравнению с группой WT. (P <0,05, рис. 4B, C)
Рис. 4.
MiR-122a может привести к повышению проницаемости кишечника. (A) Трансэпителиальное электрическое сопротивление было снижено после сверхэкспрессии miR-122a в клетках Caco-2. (B) Относительная интенсивность увеличилась после сверхэкспрессии miR-122a. (C) Поток маннита был увеличен у мышей группы miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой дикого типа. (D) Устойчивость была снижена у мышей группы miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой дикого типа. (E) Уровень лактулозы/маннита был выше в группе miR-TG по сравнению с контрольной группой WT на 4, 8 и 12-недельных мышах. (F) Экскреция сукралозы была выше в группе miR-122a-TG по сравнению с контрольной группой мышей дикого типа в возрасте 4 лет, в возрасте 8 лет и 12-недельных мышей в возрасте 9 лет.0024 in vivo . * Р < 0,05, ** Р < 0,05.
Было проведено три независимых эксперимента для клеточного теста и десять для мышей.
Рис. 5.
МиР-122а может вызывать воспаление кишечника. (A) Масса тела мышей miR-122a-TG была ниже у мышей в возрасте 8 и 12 недель. (B, C) Уровни IL-6 и TNF-α были выше у мышей miR-122a-TG по сравнению с группой WT в крови мышей. (D, E) Уровень экспрессии miR-122a и зонулина был выше у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника по сравнению с контрольной группой добровольцев в тканях толстой кишки. (F, G) Уровни IL-6 и TNF-α были выше у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника по сравнению с контрольной группой добровольцев в крови. * Р < 0,05, ** Р < 0,05. Было проведено десять независимых экспериментов.
Клинические образцы также использовали для исследования клинических признаков miR-122a. Свежие ткани толстой кишки ВЗК и парные соседние нормальные ткани толстой кишки собирали для определения уровня экспрессии mR-122a в тканях с помощью qRT-PCR. Уровни миР-122a в тканях толстой кишки при ВЗК были значительно выше, чем в парных соседних нормальных тканях толстой кишки.
(P <0,05, рис. 5D). Экспрессия зонулина на уровнях мРНК увеличилась в тканях толстой кишки при ВЗК по сравнению с парными соседними нормальными тканями толстой кишки. (P <0,05, рис. 5E). Уровни IL-6 и TNF-α в сыворотке, определенные с помощью набора ELISA (RayBiotech, США), были повышены у пациентов с ВЗК, чем у здоровых добровольцев. (P <0,05, рис. 5F, G)
Обсуждение
Кишечный барьер в основном состоит из целых эпителиальных клеток кишечника [23] с плотным соединением между соседними клетками [24, 25]. Кишечник человека сталкивается с наибольшей бактериальной нагрузкой, примерно более 500 различных видов микроорганизмов [26]. Поэтому мы стремимся исследовать взаимосвязь между микроРНК и барьерной функцией кишечника.
TNF-α может повышать экспрессию miR-122a в энтероцитах, культивируемых клетках и тканях кишечника и тем самым вызывать деградацию мРНК окклюдина и повышать проницаемость кишечника [11]. Напротив, зонулин может быть индикатором кишечного барьера, который был первоначально обнаружен в 2000 году как мишень для токсина zonula occludens [12].
Наше предыдущее исследование показало, что частота инфекций после периоперационного лечения пробиотиками была ниже, чем в контрольной группе [12]. Пробиотики могут снижать уровень сывороточного зонулина, продолжительность послеоперационной лихорадки, продолжительность антибактериальной терапии и частоту послеоперационных инфекционных осложнений [12]. Наше настоящее исследование было направлено на изучение механизма молекулярной регуляции миР-122a уровня экспрессии зонулина для лечения дисфункции кишечного барьера. Было показано, что ЛПС является фактором повреждения кишечного барьера [27], и мы впервые проверили влияние ЛПС на уровень экспрессии зонулина и миР-122а. Результаты показали, что уровни экспрессии miR-122a и зонулина были повышены после обработки LPS. Однако уровень экспрессии EGFR снижался только на уровне экспрессии белка, а не на уровне мРНК, определенном с помощью qRT-PCR, из-за посттранскрипторной регуляции EGFR, например, регулируемой miR-122a. Мыши MiR-122a-TG и первичная культура клеток кишечника могут дополнительно подтвердить регуляторные эффекты miR-122a на экспрессию EGFR.
МиР-122а также может быть регулятором кишечного барьера.
Анализ люциферазы подтвердил, что EGFR является мишенью miR-122a. Трансфекция miR-122a в клетки Caco-2 приводила к снижению экспрессии EGFR только на уровне белка, определяемом вестерн-блоттингом, который ингибировался на посттранскрипторном уровне, тогда как мРНК EGFR не затрагивалась, как регуляторный механизм микроРНК [1, 15, 28]. Совместная транскрипция EGFR с миР-122а может перекрывать эффекты миР-122а на повышенный уровень экспрессии зонулина, возможно, потому, что повышенный уровень EGFR поддерживает ингибирование молекулярной регуляции экспрессии зонулина. Наоборот, miR-122a может проявлять свои эффекты путем ингибирования транскрипции EGFR.
Проницаемость кишечника увеличивалась после сверхэкспрессии miR-122a и в группе miR-122a-TG, что соответствовало уровню зонулина, и это увеличение могло быть показателем кишечной проницаемости, как сообщалось [12]. Воспалительные цитокины IL-6 и TNF-α также были параллельны уровню экспрессии miR-122a.
Таким образом, мы пришли к выводу, что LPS может стимулировать экспрессию miR-122a и, следовательно, ингибировать посттранскрипторную экспрессию EGFR, повышать экспрессию и способствовать кишечной проницаемости и воспалению кишечника (LPS-miR122a-EGFR-зонулин-кишечная проницаемость-воспаление). Мы предположили, что LPS может вызывать дисфункцию кишечного барьера через путь miR-122a.
В молекулярном механизме miR-122a miR-122 регулирует синтез белка CAT-1; мРНК нацелена на Р-тела, которые могут быть разгружены белком HuR, высвобождаемым из ядра в условиях стресса [29]; Взаимодействие HuR приводит к высвобождению мРНК из P-телец [29]. Многочисленные другие мишени, такие как CD320, AldoA и BCKDK, также были идентифицированы с помощью микрочипа изменений в печени мышей, получавших ингибиторы miR-122 [30-32]. Другие сообщения показали, что miR-122 также может регулировать системный гомеостаз железа с помощью Hjv и Hfe [33], тогда как ингибирование miR-122 у мышей или приматов не приводит к какой-либо обнаруживаемой токсичности для печени [34].
Молекулярный механизм miR-122a, особенно для зонулина, не описан. В нашем исследовании изучался молекулярный механизм miR-122a на экспрессию зонулина через путь EGFR, который является рецептором клеточной поверхности для членов семейства внеклеточных белковых лигандов эпидермального фактора роста [35]. Большинство исследований miR-122a были сосредоточены на гепатоцеллюлярной карциноме [36], которая может снижать онкогенные свойства в клеточных линиях ГЦК, и она действует как ген-супрессор опухоли и увеличивает ответ на химиотерапевтические препараты сорафениб [37]. Было идентифицировано несколько генов-мишеней miR-122, включая ADAM10, IGF1R, CCNG1 и ADAM17 [37, 38]. Следовательно, другие пути передачи сигнала также нуждаются в дальнейшем изучении. В нашем исследовании мы в основном обращали внимание на путь EGFR, который мог регулироваться miR-122a, что приводило к чередованию зонулина. Молекулярная мишень, такая как miR-122a, EGFR и зонулин, может быть использована в качестве потенциальных терапевтических мишеней.
Наше исследование может быть ограничено недостаточными исследованиями связи между зонулином и белками, связанными с плотными контактами. Дальнейшие тесты могут быть необходимы для наших будущих исследований.
Заключение
miR-122a может действовать как позитивный фактор зонулина путем нацеливания на EGFR, который повышает проницаемость эпителия кишечника in vivo и in vitro .
Благодарности
Эта работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81370480, 81670480), Учебной программы Плана крупных исследований Фонда естественных наук провинции Гуандун (2014A030308004) и талантов высокого уровня в провинции Гуандун. Специальный план поддержки провинции — Молодежные таланты в области науки и техники (2015TQ01R334).
Заявление о раскрытии информации
Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.
0 International License (CC BY-NC-ND). Использование и распространение в коммерческих целях, а также любое распространение измененного материала требует письменного разрешения. Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством. Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам.
