Мк 1а крот: -1-02. , -1-02. -1-02 , (

a Изображение гель-электрофореза в импульсном поле NSF-HA и MSF-HA. Эксперимент был повторен один раз с аналогичным результатом. b NSF-HA, но не MSF-HA, подавляет гибель клеток, вызванную окислительным стрессом, в клетках IMR90. Процент живых клеток измеряли путем окрашивания аннексином-V/PI через 1 день после 1 часа обработки 3 мМ tBHP ( n  = 3). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA, MSF-HA или PBS перед обработкой tBHP. c NSF-HA, но не MSF-HA, подавляет индуцированную окислительным стрессом остановку роста в клетках IMR90 ( n  = 4). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA, MSF-HA или PBS, затем ГК удаляли и клетки подвергали воздействию 200 мкМ tBHP в течение 1 ч в день 0 и день 1. d Изображение гель-электрофореза в импульсном поле cNSF-HA и fNSF-HA. Эксперимент был повторен один раз с аналогичным результатом. e cNSF-HA, но не fNSF-HA, подавляет вызванную окислительным стрессом гибель клеток IMR90. Процент живых клеток измеряли путем окрашивания аннексином-V/PI через 1 день после 1 часа обработки 3 мМ tBHP ( n  = 3). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS перед обработкой tBHP. f cNSF-HA, но не fNSF-HA, подавляет индуцированную окислительным стрессом остановку роста IMR90 ячеек ( n  = 4). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS, затем удаляли HA и подвергали клетки воздействию 200 мкМ tBHP в течение 1 часа в день 0 и день 1. г Тепловая карта показывает нормализованное по CD44 содержание 99 ко-иммунопреципитированных белков CD44, которые по-разному связаны с CD44 в клетках IMR90 со сверхэкспрессией CD44. Клетки инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS. Эксперимент проводился в трехкратной повторности. ( ч ) Вестерн-блоты, показывающие обилие коиммунопреципитированного CD44-FLAG CD44-YFP в клетках IMR90, сверхэкспрессирующих CD44-FLAG и CD44-YFP ( n  = 9). Клетки инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS. i Количественная оценка Вестерн-блоттинга показана в ( h ) на изображении J. Столбики погрешностей представлены как среднее ± ± стандартное отклонение. * p  < 0,05 (односторонний ANOVA с апостериорным двусторонним критерием Даннета).

Полноразмерное изображение

vHMM- и HMM-HA оказывают противоположное влияние на интерактом CD44

Тот факт, что цитопротекторный эффект NSF-HA зависит от CD44 и его исключительной длины полимера, предполагает, что vHMM-HA и HMM-HA регулируют сигналы CD44 по-разному. Чтобы проверить это мнение, мы проанализировали влияние ГК на белок-белковые взаимодействия CD44. Мы сверхэкспрессировали стандартную форму CD44 в клетках IMR90 (дополнительная фигура 4A) и провели анализ коиммунопреципитации CD44 через 6 ч после инкубации с cNSF-HA, fNSF-HA или PBS. Большинство эндогенных молекул CD44 имели стандартную форму в IMR9.0, MSF ¹⁰ и NSF (дополнительный рисунок 4B, C). CD44 и его интеракторы перекрестно связывали с DSP и DTME перед сбором клеток. Затем иммунопреципитированные белки подвергали количественной масс-спектрометрии с тандемной масс-меткой (ТМТ). Это выявило 290 ко-иммунопреципитированных белков с обогащением как минимум в два раза по сравнению с контролем IgG (дополнительный набор данных 1). Из них 109 белков (38%) уже описаны как белки, взаимодействующие с CD44 ²⁵ , что указывает на успех коиммунопреципитации. Мы сравнили количество ко-иммунопреципитированных белков CD44 после нормализации до уровней CD44 и определили 99 белков должны по-разному ассоциироваться с CD44 в клетках IMR90, инкубированных с cNSF-HA и fNSF-HA ( p  < 0,05). Поразительно, но эффективность коиммунопреципитации всех этих белков была выше в клетках, инкубированных с fNSF-HA, чем в клетках, инкубированных с cNSF-HA (дополнительный набор данных 1). Более того, по сравнению с PBS, cNSF-HA снижал эффективность коиммунопреципитации большинства этих белков, тогда как fNSF-HA в основном усиливал ее (рис. 2g). Эти результаты показывают, что белок-белковые взаимодействия CD44 стимулируются HMM-HA, но подавляются vHMM-HA. Затем, чтобы прояснить влияние vHMM-HA на белковое взаимодействие CD44-CD44, мы одновременно сверхэкспрессировали CD44-FLAG и CD44-YFP в IMR9.0 клеток и исследовали их взаимодействие с помощью анализа коиммунопреципитации FLAG. В соответствии с нашими данными масс-спектрометрии, cNSF-HA уменьшал количество коиммунопреципитированного CD44-YFP, тогда как fNSF-HA увеличивал его (рис. 2h, i). Этот результат предполагает, что очень большие молекулы vHMM-HA экранируют CD44 и уменьшают его взаимодействие с другими белками.

vHMM- и HMM-HA оказывают противоположное влияние на экспрессию генов

Наши данные показывают, что vHMM-HA защищает клетки, повышая устойчивость клеток к стрессу посредством измененной передачи сигналов CD44. В подтверждение этого мнения, предварительная инкубация с NSF-HA не снижала индукцию внутриклеточных АФК после обработки tBHP у IMR9.0 ячеек (дополнительный рис. 5A). Кроме того, непродолжительное лечение HAase после инкубации NSF-HA не ухудшило его цитозащитный эффект (дополнительная рис. 5B, C). Это указывает на то, что остаточная перицеллюлярная ГК вряд ли важна для цитопротекции. Хотя интернализованный HA может быть вовлечен, наши данные, тем не менее, предполагают, что внутриклеточные сигналы ниже CD44 играют ключевую роль в цитопротекции с помощью vHMM-HA.

Таким образом, для дальнейшего изучения механизмов цитопротекторного эффекта мы сначала стремились выяснить, как vHMM-HA влияет на сигнатуру транскрипции в стрессовых клетках. Мы сравнили транскриптомы IMR90 клеток через 6 ч после начала 1-часовой обработки низкой дозой tBHP и идентифицировали 745 генов, которые по-разному экспрессируются между предварительно инкубированными клетками cNSF-HA – и fNSF-HA ( q  < 0,05; далее обозначаемые как HA гены, зависящие от длины полимера). Уровни экспрессии большинства этих генов противоположно регулировались cNSF-HA и fNSF-HA (достоверная отрицательная корреляция; тест корреляции Спирмена, p  < 2,2 × 10 ^-16 ) (рис. 3a), как и в случае с Белок-белковые взаимодействия CD44. Таким образом, хотя ИПП CD44 исследовали в условиях сверхэкспрессии CD44, которая может повлиять на результаты, наши протеомный и транскриптомный анализы показали противоположные эффекты cNSF-HA и fNSF-HA. Анализ генетической онтологии ²⁶ генов, зависящих от длины полимера HA, показали обогащение генами, кодирующими регуляторы и интеракторы p53 (рис. 3b). Затем мы провели анализ обогащения сайта связывания фактора транскрипции (TFBS) на основе мотива ²⁷ и обнаружили, что мишени регулируемых CD44 факторов транскрипции, таких как ELK1 ²⁸ и EGR1 ²⁹ , были чрезмерно представлены в генах, зависящих от длины полимера HA. (рис. 3в). Более того, было показано, что наиболее обогащенные мишени фактора транскрипции, а именно мишени HIF1α, значительно перекрываются с мишенями CD44-ICD (внутрицитоплазматический домен CD44), который образуется в результате протеолиза CD44 ³⁰ . Действительно, уровни CD44-ICD были ниже в клетках, инкубированных с fNSF-HA (дополнительная фигура 6), и наблюдалось обогащение мотива связывания CD44-ICD (CCTGCG) в промоторных областях размером 500 п. н. генов, зависящих от длины полимера HA. (рис. 3d).

a Гены, дифференциально экспрессирующиеся в клетках IMR90 при обработке cNSF-HA или fNSF-HA (гены, зависящие от длины полимера HA). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS, затем удаляли HA и клетки подвергали воздействию 200 мкМ tBHP в течение 1 часа. Клетки собирали через 6 ч после начала обработки tBHP. b Обогащение GO Term, пути Reactome и белок-белковых взаимодействий фактора транскрипции (PPI) в генах, зависящих от длины полимера HA. c , d Обогащение сайтов связывания факторов транскрипции (TFBS) в генах, зависящих от длины полимера HA. Белые столбцы представляют собой обогащение TFBS всеми генами, зависящими от длины полимера HA. Серые столбцы представляют собой обогащение TFBS генами, зависящими от длины полимера HA, которые участвуют в регуляции транскрипции с помощью p53 или кодируют белки, взаимодействующие с p53. Черные столбцы представляют собой обогащение TFBS генами-мишенями p53, зависящими от длины полимера HA. e Дифференциальные уровни экспрессии генов, зависящих от длины полимера HA (определяемых в присутствии tBHP), в клетках IMR90, инкубированных в течение 6 ч с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или PBS. f Скрипичный график представляет собой распределение p -значений двустороннего t -критерия, сравнивающего уровни экспрессии генов, зависящих от длины полимера HA, и генов, независимых от длины полимера HA (определено в наличие tBHP) между cNSF-HA- и fNSF-HA-инкубированным IMR90 ячеек. Клетки инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл cNSF-HA или fNSF-HA без дополнительной обработки tBHP. г Дифференциальные уровни экспрессии генов, зависящих от длины полимера HA (определялись в присутствии tBHP) в контрольных и сверхэкспрессирующих CD44 клетках IMR90, инкубированных в течение 6 ч с 20 мкг/мл cNSF-HA или PBS.

Изображение в полный размер

Все эти обогащения TFBS становятся более заметными, когда анализ был ограничен генами, зависящими от длины полимера HA, кодирующими регуляторы и интеракторы p53 (рис. 3d), что подразумевает основную роль пути p53 в CD44-зависимый цитопротекторный эффект NSF-HA. В соответствии с этими наблюдениями произошло значительное обогащение курируемых высоконадежных генов-мишеней p53 ³¹ в генах, зависящих от длины полимера HA (точный критерий Фишера, p  = 1,7 × 10 ^-6 ) (дополнительный рисунок 7A). Примечательно, что предварительная инкубация cNSF-HA подавляла экспрессию большинства генов-мишеней p53, зависящих от длины полимера HA (дополнительная фиг. 7A, B). При этом большинство генов-мишеней p53 одинаково реагируют на окислительный стресс в клетках cNSF-HA, fNSF-HA и PBS (дополнительная рис. 7C). HA также не влияла на цитоплазматический и ядерный уровни p53 (дополнительная рис. 7D – G). Гены-мишени CD44-ICD и CD44-регулируемых факторов транскрипции не были обогащены генами-мишенями p53, зависящими от длины полимера HA (рис. 3d), что позволяет предположить, что транскрипционная модуляция генов-мишеней p53, зависящих от длины полимера HA, является следствием измененных экспрессия генов, кодирующих регуляторы и интеракторы р53, которые регулируются CD44-регулируемыми транскрипционными факторами и CD44-ICD.

Интересно, что мы обнаружили, что ранние изменения экспрессии генов, чувствительных к стрессу, индуцированные tBHP и облучением ³² , показывают положительную корреляцию с изменениями экспрессии генов, индуцированными предварительной инкубацией cNSF-HA в генах, зависящих от длины полимера HA (критерий корреляции Спирмена, ). p  < 2,2 × 10 ⁻¹⁶ для tBHP и p  = 3,2 × 10 ⁻⁵ для облучения, дополнительный рисунок 7H). Это удивительно, поскольку гены-мишени p53 в целом преимущественно активировались при этих ранних реакциях на стресс (дополнительная фигура 7A). Эти результаты свидетельствуют о том, что предварительная инкубация cNSF-HA потенцирует подмножество ранней реакции на стресс, которая особенно связана с супрессией p53.

Важно отметить, что транскриптомный анализ не подвергнутых стрессу клеток IMR90, инкубированных с cNSF-HA, fNSF-HA и PBS, показал, что изменения экспрессии большинства генов, зависящих от длины полимера HA, уже индуцировались до обработки tBHP (рис. 3e). ). Другие гены показали гораздо меньшие эффекты, зависящие от длины полимера HA, в этих клетках (рис. 3f). RT-qPCR анализ клеток IMR90 без стресса и CD44-нокдауна подтвердил, что зависящие от длины полимера эффекты HA на экспрессию генов-мишеней p53 ( RRM2B ³³ , PRRX2 ²⁵ и PYCARD ³⁴ ) опосредуются CD44 (дополнительный рисунок 8). Наконец, чтобы дополнительно подтвердить роль передачи сигналов CD44 в регуляции генов, зависящих от длины полимера HA (и в дополнение к протеомному анализу, описанному в предыдущем разделе), мы провели транскриптомный анализ ложно- и CD44-сверхэкспрессирующих клеток IMR90 под нестрессовые состояния. Как и ожидалось на основании вышеприведенного протеомного анализа, транскрипционный эффект сверхэкспрессии CD44 на гены, зависящие от длины полимера HA, в значительной степени подавлялся при инкубации клеток с cNSF-HA. В генах, зависящих от длины полимера HA, изменения экспрессии, вызванные сверхэкспрессией CD44, в IMR9, обработанном PBS0 и клетки, индуцированные обработкой cNSF-HA в клетках IMR90 со сверхэкспрессией CD44, показали значительную отрицательную корреляцию (корреляционный тест Спирмена, p  < 2,2 × 10 ^-16 ) (рис. 3g). В совокупности эти данные показывают, что vHMM-HA противодействует транскрипционному эффекту HMM-HA и CD44 и, таким образом, изменяет экспрессию интеракторов и регуляторов p53, которые потенциально находятся под контролем факторов транскрипции, связанных с CD44, что приводит к снижению экспрессии подмножества генов-мишеней p53.

vHMM-HA защищает клетки посредством ослабления p53

Затем мы попытались выяснить, влияют ли vHMM-HA и HMM-HA по-разному на статус самого p53. Мы исследовали основные сайты фосфорилирования N-конца p53 и обнаружили, что p53 Ser9 был менее фосфорилирован в клетках, инкубированных с cNSF-HA, чем в клетках, инкубированных с fNSF-HA (рис. 4a, b и дополнительная рис.  9). Чтобы проверить, действительно ли p53 участвует в цитопротекторном эффекте NSF-HA, мы сбили p53 в клетках IMR90, используя проверенную миРНК 9.0009 35 . Клетки IMR90, в которых был нокдаун p53, все еще были чувствительны к tBHP, но больше не были защищены предварительной инкубацией NSF-HA (рис. 4c–e). Поскольку siRNA не может полностью заглушить ген-мишень, мы затем провели тот же эксперимент с использованием MSF ³⁶ с нокаутом p53 дикого типа. Подобно клеткам IMR90, MSF с нокаутом p53 все еще были чувствительны к tBHP, но не были защищены предварительной инкубацией NSF-HA (рис. 4f–h). Основываясь на этих результатах, мы делаем вывод, что цитопротекторный эффект NSF-HA опосредуется, по крайней мере, частично за счет ослабления пути p53.

a Вестерн-блоты, показывающие уровни p-p53-Ser9 в клетках IMR90, обработанных 20 мкг/мл cNSF-HA или fNSF-HA в течение 6 часов. b Количественная оценка Вестерн-блотов показана в ( a ) на изображении J. Средние значения взяты из трех биологических повторов. Для каждой биологической повторности иммуноблотинг проводили трижды и усредняли. c Нокдаун p53 отменяет цитопротекторный эффект NSF-HA на гибель клеток, вызванную окислительным стрессом, в IMR90 ячеек. Процент живых клеток измеряли путем окрашивания аннексином-V/PI через 1 день после 1 часа обработки 3 мМ tBHP ( n  = 3). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA или PBS перед обработкой tBHP. siRNA трансфицировали за 2 дня до первой обработки tBHP. d p53-нокдаун отменяет цитопротекторный эффект NSF-HA на индуцированную окислительным стрессом остановку роста в клетках IMR90 ( n  = 4). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA или PBS в течение 6 ч, затем ГК удаляли и клетки подвергали воздействию 200 мкМ tBHP в течение 1 ч в день 0 и день 1. миРНК трансфицировали за 2 дня до день 0. e Подтверждение нокдауна p53 в клетках IMR90 вестерн-блоттингом. Клетки собирали через 2 дня после трансфекции р53 или контрольной миРНК. Иммуноблотинг был повторен один раз с аналогичным результатом. f Нокаут p53 отменяет цитопротекторный эффект NSF-HA на гибель клеток MSF, вызванную окислительным стрессом. Процентное содержание живых MSF измеряли путем окрашивания аннексином-V/PI через 1 день после 1 часа обработки 1,5 мМ tBHP ( n  = 3). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA или PBS перед обработкой tBHP. г p53-нокаут отменяет цитопротекторный эффект NSF-HA на индуцированную окислительным стрессом остановку роста MSF ( n  = 4). Клетки предварительно инкубировали в течение 6 ч с 20 мкг/мл NSF-HA или PBS в течение 6 ч, затем ГК удаляли и клетки подвергали воздействию 150 мкМ tBHP в течение 1 ч в день 0 и день 1. ч Подтверждение нокаута p53 в MSF с помощью вестерн-блоттинга. Иммуноблотинг был повторен один раз с аналогичным результатом. Столбики погрешностей представлены в виде средних значений ± SD. * p  < 0,05 (двусторонний т -тест).

Изображение полного размера

Обсуждение

Хотя внеклеточный матрикс составляет основную часть тела, его связь со старением остается в значительной степени неизученной. HA, линейный полисахарид и основной компонент внеклеточного матрикса, имеет очень высокую молекулярную массу у самого долгоживущего грызуна, NMR, но было неясно, способствует ли исключительная длина полимера vHMM-HA фенотипам NMR. Здесь мы продемонстрировали, что vHMM-HA (> 6,1 MDa) функционально отличается от более короткой высокомолекулярной HA и что vHMM-HA проявляет отчетливое цитопротекторное действие на клетки ЯМР, мыши и человека в зависимости от р53. образом. Наши данные в совокупности подтверждают модель, в которой vHMM-HA подавляет белок-белковые взаимодействия и передачу сигналов с помощью CD44, что приводит к изменению экспрессии интеракторов, регуляторов и мишеней р53 и, таким образом, проявляет отчетливую цитопротекцию посредством модулирования пути р53 (рис. 5). Наши результаты показывают, что vHMM-HA способствует долговечности ЯМР, и подчеркивают потенциальное применение vHMM-HA в качестве цитозащитной молекулы.

Наши данные показывают, что vHMM-HA ослабляет белок-белковые взаимодействия CD44 (PPI), тогда как HMM-HA их усиливает. Одновременно vHMM-HA подавляет экспрессию CD44-зависимых генов, в том числе регулируемых CD44-зависимыми факторами транскрипции, такими как ELK, EGR1 и CD44-ICD. Таким образом, vHMM-HA и HMM-HA вызывают противоположные эффекты на экспрессию CD44-зависимых генов, которые также связаны с путем р53. В результате vHMM-HA частично ослабляет р53 и его гены-мишени и защищает клетки р53-зависимым образом.

Изображение в натуральную величину

Следует отметить, однако, что наши механические исследования были в значительной степени ограничены клетками человека как клинически значимой моделью. Гены, участвующие в механизмах, опосредующих защитный эффект vHMM-HA, могут различаться у разных видов. Например, существуют значительные различия в генах, регулируемых p53, между человеком и мышью ³⁷ . Неудивительно, что аминокислотные последовательности р53 различаются у человека, мыши и ЯМР ³⁸ , хотя о функциональных различиях между NMR и двумя другими видами не сообщалось. Еще одним важным ограничением нашего исследования является то, что мы сосредоточились только на отличительном цитопротекторном эффекте vHMM-HA. Другие функции также могут различаться между vHMM-HA и более коротким HMM-HA. Кроме того, в то время как сигналы CD44-p53 играют критическую роль в цитозащитном эффекте vHMM-HA, другие HA-связывающие белки, такие как versican ³⁹ , а также другие аспекты CD44, такие как образование молекулярных комплексов ⁴⁰ и частокол ⁴¹ , могут быть вовлечены в цитопротекторный эффект или другую функцию vHMM-HA. Хотя эти вопросы выходят за рамки данного исследования, наши протеомные и транскриптомные данные могут быть полезными ресурсами для решения этих вопросов.

В текущем исследовании мы в основном использовали ГК естественного происхождения, которые имеют значительную полидисперсность, и, таким образом, может быть функциональная гетерогенность даже внутри vHMM-HA и HMM-HA. Однако, основываясь на результатах наших экспериментов с использованием гель-экстрагированного vHMM-HA и 1 МДа Select-HA ^TM , мы можем заключить, что vHMM-HA с молекулярной массой более 6,1 МДа обладает превосходным защитным эффектом по сравнению с 1 МДа HA или MSF-HA, состоящим из HMM-HA с молекулярной массой менее 6,1 МДа. Вывод о том, что NSF-HA обладает лучшим цитопротекторным эффектом по сравнению с MSF-HA, также верен. Эти выводы предполагают вклад vHMM-HA в стрессоустойчивость и долговечность ЯМР.

Хотя vHMM-HA частично ослабляет активность опухолевого супрессора p53, ЯМР, тем не менее, чрезвычайно устойчив к канцерогенезу. Одно из объяснений состоит в том, что vHMM-HA-индуцированная частичная аттенуация р53 не обязательно может ставить под угрозу его супрессорную активность. Действительно, в целом гены-мишени p53 очень сходно реагируют на окислительный стресс в клетках, инкубированных с PBS и HA. Дифференциальная модуляция транскрипции подмножества генов-мишеней p53 с помощью cNSF-HA и fNSF-HA может быть следствием измененной экспрессии генов, кодирующих регуляторы и интеракторы p53, которые регулируются CD44-регулируемыми транскрипционными факторами и CD44-ICD.

Наше наблюдение, что на физиологических уровнях vHMM-HA лучше защищает клетки человека от стресса, чем более короткие HMM-HA, имеет важное клиническое значение, учитывая широкое медицинское применение HA ⁴² . Производство ГК с более высокой молекулярной массой может привести к улучшению медицинских продуктов на основе ГК.

Методы

Культура клеток

NSF и MSF были выделены в нашей лаборатории ⁴³ из кожи молодых взрослых мышей NMR и C57BL/6J, соответственно. Фибробласты кожи выделяли из образцов кожи, взятых у умерщвленных животных, путем измельчения и переваривания их с помощью 0,14 единиц Вунча/мл Liberase TM (Roche Diagnostics) в среде DMEM/F12 при 37°С в течение 60 мин. Все животные содержались в соответствии с правилами, установленными и одобренными Комитетом по животным ресурсам Университета Рочестера (UCAR), который придерживается рекомендаций FDA и NIH по уходу за животными и проверяет все протоколы животных до утверждения. IMR90 фибробластов легких человека были получены из Института медицинских исследований Кориелла. Клетки HEK293T были получены от ATCC. Клетки NSF, MSF и IMR90 культивировали в среде EMEM с добавлением 15% FBS. NSF культивировали при 32 °C, 4,8% CO ₂ , 2,8% O ₂ . Клетки MSF и IMR90 культивировали при 37 °C, 5% CO ₂ , 4% O ₂ . Количество пассажей клеток NSF, MSF и IMR90 составляло менее 20, 5 и 40 соответственно. В клетках IMR90 последовательность всех экзонов p53 была проверена с использованием наших данных RNA-Seq, и было обнаружено отсутствие мутаций. Подсчет клеток проводили с использованием культуральных чашек с сеткой.

Анализ апоптоза

Количественное определение апоптотических клеток проводили с использованием набора для обнаружения апоптоза аннексин-V (eBioscience) в соответствии с инструкциями производителя. После окрашивания клетки анализировали на проточном цитометре LSR-II (BD Biosciences).

Препарат ГК

Для очистки ГК кондиционированные среды сначала смешивали с раствором протеиназы К (конечные концентрации 1 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 2,5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,05% SDS, 1 мг/мл протеиназы К) и инкубировали при 55°С в течение 4 ч. После расщепления белка среду экстрагировали насыщенным раствором фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (Sigma). ГК осаждали этанолом и центрифугированием (4000× г в течение 45 мин). Осадок ГК растворяли в PBS и затем экстрагировали 1/100 объема Triton-X114 ⁴⁴ . После экстракции Тритоном-Х114 ГК снова осаждали этанолом. Наконец, осадок ГК промывали 70% этанолом и растворяли в PBS. Для гель-экстракции vHMM-HA NSF-HA использовали на 0,7% легкоплавкой агарозе (бляшка Agarose-LM; Nacalai Tesque) в буфере TBE. Маркерную дорожку отрезали от геля и окрашивали, как описано ниже. Гель, содержащий NSF-HA, с маркерной полосой выше 6,1 MДа, вырезали, и vHMM-HA выделяли из геля с помощью термостабильной агаразы (ген Nippon) в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный vHMM-HA затем экстрагировали PCI и Triton-X114 и осаждали этанолом, как описано выше. Концентрацию ГК измеряли с помощью карбазольного анализа ⁴⁵ . Streptomyces HAase (Sigma) использовали для деградации HA в кондиционированных средах и для частичной фрагментации HA. HA частично фрагментировали путем инкубации с 0,5 ед/мл HAase при 37°C в течение 60 мин с последующей тепловой инактивацией при 95°C в течение 10 мин. Select-HA ^TM был от Echelon Biosciences. Для блокирования взаимодействий HA/CD44 в культуральную среду добавляли нейтрализующее антитело к CD44 (Clone 2C5; R&D) в концентрации 10 нг/мл.

Экстракция РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали с помощью RNAiso Plus (Takara) и подвергали обратной транскрипции в кДНК со случайными гексамерами с использованием набора реагентов PrimeScript (Takara). КПЦР в реальном времени проводили с использованием TB Green ^TM Premix Ex Taq II ^TM (Takara) с системой ПЦР в реальном времени Step ONE Plus (Life Technologies). В этом исследовании использовались следующие праймеры: ACTB вперед, AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG; АКТВ реверс GCCGGACTCGTCATACTCCT; CD44 вперед, TGGTGAACAAGGAGTCGTCA; CD44 реверс, ACACCCCAATCTTCATGTCC; PRRX2 вперед, AGGTGCCTACGGTGAACTGA; PRRX2 реверс, CTGCCCCCTTTTCTATTGCT; PYCARD вперед, TGACGGATGAGCAGTACCAG; PYCARD реверс, CAGGCTGGTGTGTGAAACTGAA; RHAMM вперед, AGCAAGAAGGCATGGAGATG; RHAMM реверс, CCCTCCAGTTGGGCTATTTT; RRM2B вперед, GCCAGGACTCACTTTTTTCCA; РРМ2Б реверс, TCCCTGACCCTTTCTTCTGA.

Гель-электрофорез в импульсном поле

Очищенную ГК смешивали с раствором сахарозы (конечная концентрация 333  мМ) и загружали в 0,4% агарозный гель SeaKem Gold (Lonza). Вместе с образцами запускали HA-Ladders (Hyalose). Образцы анализировали в течение 12 ч при 4°С и 75°В с рабочим соотношением 1–10 в буфере ТВЕ с использованием системы CHEF-DRII (Bio-Rad). После анализа гель окрашивали 0,005% (масса/объем) красителем Stains-All (Santa Cruz) в 50% этаноле в течение ночи. Затем гель дважды промывали 10% этанолом, подвергали воздействию света для уменьшения фона и фотографировали с помощью ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Клетки промывали PBS и фиксировали 4% формальдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. После фиксации клетки промывали 3% BSA/PBS и пермеабилизировали 0,5% Triton X-100/PBS при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем клетки промывали 3% BSA/PBS и блокировали блокирующим буфером (10% FBS и 1% BSA в PBS) при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем клетки инкубировали с антителами γh3AX (JBW301; Millipore; 1:500) и 53BP1 (ab172580; Abcam; 1:500) в блокирующем буфере при 4 °C в течение ночи и промывали PBST. Наконец, клетки инкубировали с козьим антимышиным IgG Alexa Fluor 488 и козьим антикроличьи IgG Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific; 1:1000) в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 1 часа, промывали PBST и помещали в Vectashield. содержащий DAPI (Vector Laboratories). Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Leica SP5.

Получение клеток IMR90 со сверхэкспрессией CD44

Клетки IMR90 со сверхэкспрессией CD44 и CD44-FLAG получали с помощью вирусной трансдукции и отбора 1  мкг/мл пуромицина. Клетки IMR90 со сверхэкспрессией CD44-FLAG дополнительно трансдуцировали ретровирусным вектором, несущим CD44-YFP, и отбирали с помощью FACS (Sony SH800). Ретровирусный супернатант готовили путем совместной трансфекции клеток HEK293T векторами VSV-G, pUMVC и pBabe-puro. Пустые и экспрессирующие CD44s векторы pBabe были получены от Addgene (#1764 и #19). 127). CD44 были клонированы в pcDNA3.1-ZNF598-TEV-3xFLAG (#105690, Addgene) и pcDNA3-YFP (#13033, Addgene) для получения CD44-FLAG (C-конец) и CD44-YFP (C-конец) соответственно. . Затем CD44-FLAG и CD44-YFP клонировали обратно в вектор pBabe для получения вируса.

Иммунопреципитация

Клетки инкубировали с 20 мкг/мл cNSF-HA, fNSF-HA или эквивалентным объемом PBS в течение 6 ч, затем среду удаляли и клетки сшивали в PBS, содержащем 500 мкМ DSP и 500 мкМ DTME (Thermo Fisher Scientific) в течение 30 мин при комнатной температуре. Сшивку гасили инкубацией с PBS, содержащим 20 мМ Tris-Cl (pH 7,4) и 5 ​​мМ L-цистеина (Sigma). Клетки собирали в буфере RIPA (50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолевая кислота, 0,1% SDS) с добавлением полного коктейля ингибиторов протеазы (Sigma). После лизиса клеток буфер заменяли 0,05% TBST с использованием колонки Vivaspin (MWCO = 10 кДа) (GE Healthcare). Иммунопреципитацию проводили из 200 мкг лизатов с 6 мкг антител к CD44 (3 мкг антител Abcam к CD44 (кат. ab157107) и 3 мкг антител Proteintech к CD44 (кат. 15675-1-AP)), нормальные кроличьи IgG (Cell Signaling Technology), антитела против FLAG (M2; sigma) или нормальные мышиные IgG (CST) с использованием магнитных шариков Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific). Антитела перекрестно связывали с гранулами с помощью DMP (Thermo Fisher Scientific) перед иммунопреципитацией. Иммунопреципитанты элюировали путем инкубации с RIPA-буфером с добавлением 50 мМ ДТТ в течение 20 мин при 70°С.

Масс-спектрометрия

CD44-иммунопреципитанты расщепляли трипсином и очищали с использованием колонки S-Trap (Protifi). Пептиды были отправлены в Ресурсную лабораторию масс-спектрометрии Университета Рочестера для 10-плексного мечения ТМТ и масс-спектрометрии. Образцы разделяли с помощью ионизации наноэлектрораспылением на приборе Orbitrap Fusion Lumos MS. Отнесение пептидов проводили с использованием Proteome Discoverer и Sequest, а ионы MS3 использовали для количественного определения содержания белка.

Транскриптомный анализ

РНК экстрагировали с использованием Trizol (Invitrogen). Образцы РНК были отправлены в Исследовательский центр геномики Университета Рочестера для RNA-Seq. Набор для подготовки образцов РНК TruSeq V2 (Illumina) использовали для создания библиотеки. Библиотеки гибридизовали с проточной кюветой Illumina с одним концом и амплифицировали с использованием cBot (Illumina) в концентрации 8 пМ на дорожку. Для каждого образца были сгенерированы чтения с одним концом из 100 нуклеотидов. Секвенирование проводили с использованием высокопроизводительного прибора Illumina HiSeqTM 2500. Нормализация и дифференциальный анализ экспрессии выполнялись с использованием DESeq2 ⁴⁶ . Анализ онтологии и путей был выполнен с использованием программы Enrichr ²⁶ . Анализ обогащения TFBS проводили с использованием программы oPOSSUM ²⁷ . Параметры, использованные в oPOSSUM, были следующими: отсечение консервации = 0,4, порог оценки матрицы = 85%, анализируемые последовательности = 2 kb выше сайтов начала транскрипции, отсечение по Z-оценке = 10, отсечение по шкале Фишера = 7.

Количественное определение внутриклеточных АФК

Уровни внутриклеточных АФК определяли количественно с использованием флуоресцентного зонда H ₂ DCFDA. Клетки предварительно инкубировали в течение 6 часов с 20 мкг/мл NSF-HA или эквивалентным объемом PBS, затем с 5 мкМ H ₂ DCFDA в HBSS в течение 30 минут, а затем подвергали воздействию 200 мкМ tBHP в течение 1 часа и промывают HBSS. Флуоресценцию DCF измеряли при возбуждении при Ex485/Em530 нм и нормализовали по количеству клеток.

Вестерн-блоттинг

Лизаты цельных клеток готовили путем лизиса клеток в лизирующем буфере (20 мМ Трис, pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1% N-лаурилсаркозин, 10 мМ NaF, 2 мМ ортованадата натрия, 1 мМ β-глицерофосфат) с добавлением полного коктейля ингибиторов протеазы (Sigma). Ядерные и цитоплазматические лизаты готовили с использованием набора ядерных экстрактов (abcam, ab113474). Лизаты и иммунопреципитаты денатурировали при 95°С (70°С для обнаружения CD44) в течение 10 мин в буфере Лэммли. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны, блокировали 5% BSA или 5% молока в TBST в течение 1 ч и зондировали следующими первичными антителами: анти-β-актин (sc-47778; Санта-Крус), анти-CD44 (ab157107; abcam), анти-FLAG (M2; сигма), анти-GFP (для обнаружения YFP) (ab6556; abcam), анти-h4 (#9715; CST), анти-p53 (человек) (10442 -1-AP; Proteintech), анти-p53 (мышь) (ab26; Abcam), анти-фосфо-p53 (Ser-9) (#9288; CST), анти-фосфо-p53 (Ser-15) (#9286; CST), анти-фосфо-p53 (Ser-46) (#2521; CST) и анти-фосфо-p53 (Thr-81) (# 2676; КНТ). Все первичные антитела разводили до концентрации 1 мкг/мл. После промывки TBST мембраны инкубировали со вторичными антителами (Sigma) (1:1000) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ), снова промывали TBST и визуализировали реагентами с усилением хемилюминесценции. Необрезанные изображения геля представлены на дополнительном рисунке 10.

РНКи

РНКи проводили путем трансфекции киРНК с использованием реагента для трансфекции RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific). Конечная концентрация миРНК составляла 50 нМ. Последовательности олигонуклеотидов siRNA были следующими. si-люцифераза: CGUACGCGGAAUACUUCGAtt. si-CD44: GAACGAAUCCUGAAGACAUCUtt ⁴⁷ . si-RHAMM: GCUAGAUAUUGCCCAGUUAtt ⁴⁸ . si-p53: AAGACUCCAGUGGUAAUCUACtt ³⁵ .

Статистика и воспроизводимость

Столбики погрешностей представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение. Для оценки статистической значимости использовали двусторонний критерий Стьюдента t и односторонний ANOVA с апостериорным двусторонним критерием Даннета, если не указано иное. Точные значения p указаны в файле исходных данных. Все реплики являются биологическими.

Сводка отчетов

Дополнительную информацию о дизайне исследования можно найти в Резюме отчета об исследованиях в природе, связанном с этой статьей.

Доступность данных

Исходные данные, лежащие в основе рис. 1a, b, d, e, 2b, c, e, f, i, 4b–d, f, g и дополнительные рис. 1A–C, 2A–H, 3B–E, G–I, 4A, B, 5A–C, 6B, 7E, G, 8A–F, 9B представлены в виде файла исходных данных. Данные RNA-Seq депонированы в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) под регистрационным номером GSE116759 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE116759.]. Данные масс-спектрометрии депонированы в ProteomeXchange с идентификатором PXD013445 [https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD013445].

Ссылки

1. Edrey, Y.H., Hanes, M., Pinto, M., Mele, J. & Buffenstein, R. Успешное старение и устойчивое хорошее здоровье голого землекопа: долгоживущая модель млекопитающих для биогеронтологии и биомедицинские исследования. ИЛАР Дж. 52 , 41–53 (2011).

   КАС пабмед Статья Google ученый

2. Руби, Дж. Г., Смит, М. и Баффенштейн, Р. Смертность голых землекопов противоречит законам Гомперца, поскольку не увеличивается с возрастом. Elife 7 , e31157 (2018).

3. О’Коннор, Т. П., Ли, А., Джарвис, Дж. У. и Баффенштейн, Р. Увеличение продолжительности жизни у голых землекопов: возрастные изменения метаболизма, состава тела и функции желудочно-кишечного тракта. Сравнительная биохимия и физиология. Часть А, Мол. интегр. Физиол. 133 , 835–842 (2002).

   Артикул Google ученый

4. Буффенштейн, Р. Незначительное старение у самого долгоживущего грызуна, голого землекопа: взгляды успешно стареющего вида. Дж. Комп. Физиол. B 178 , 439–445 (2008).

   ПабМед Статья Google ученый

5. Andziak, B. et al. Высокий уровень окислительного повреждения у самого долгоживущего грызуна — голого землекопа. Aging Cell 5 , 463–471 (2006).

   КАС пабмед Статья Google ученый

6. «>

   Де Ваал, Э. М. и др. Повышенное карбонилирование белка и окислительный стресс не влияют на структуру и функцию белка у долгоживущих голых землекопов: протеомный подход. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 434 , 815–819 (2013).

   ПабМед Статья КАС Google ученый

7. Перес В.И. и др. Белковая стабильность и устойчивость к окислительному стрессу являются определяющими факторами долголетия самого долгоживущего грызуна — голого землекопа. Проц. Натл акад. науч. США 106 , 3059–3064 (2009 г.).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

8. Родригес, К. А., Эдрей, Ю. Х., Осмульски, П., Гачинска, М. и Баффенштейн, Р. Измененный состав протеасомных комплексов печени способствует усилению протеасомной активности у исключительно долгоживущего голого землекопа. PLoS ONE 7 , e35890 (2012).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

9. Чжао, С. и др. Высокая аутофагия у голого землекопа может играть важную роль в поддержании хорошего здоровья. Клеточная физиол. Biochem 33 , 321–332 (2014).

   КАС пабмед Статья Google ученый

10. Чжао Ю. и др. Голые землекопы могут подвергаться клеточному старению, вызванному развитием, онкогенами и повреждением ДНК. Проц. Натл акад. науч. США 115 , 1801–1806 (2018).

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

11. Тянь, X. и др. Локус INK4 резистентного к опухоли грызуна, голого землекопа, экспрессирует функциональную гибридную изоформу p15/p16. Проц. Натл акад. науч. США 112 , 1053–1058 (2015).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья Google ученый

12. Miyawaki, S. et al. Опухолевая резистентность индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от голых землекопов. Нац. коммун. 7 , 11471 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

13. Селуанов А. и др. Гиперчувствительность к контактному торможению дает ключ к устойчивости голого землекопа к раку. Проц. Натл акад. науч. США 106 , 19352–19357 (2009 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

14. Тянь, X. и др. Гиалуронан с высокой молекулярной массой опосредует устойчивость голого землекопа к раку. Природа 499 , 346–349 (2013).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

15. Богумилицки Л. и др. Замаскированный обманщик: амбивалентные роли гиалуроновой кислоты в матрице. Фронт Онкол. 7 , 242 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

16. Cyphert, JM, Trempus, C.S. & Garantziotis, S. Размер имеет значение: специфичность молекулярной массы эффектов гиалуроновой кислоты в клеточной биологии. Int J. Cell Biol. 2015 , 563818 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

17. Коуман, М.К., Ли, Х.Г., Швертфегер, К.Л., Маккарти, Дж.Б. и Терли, Э.А. Содержание и размер гиалуроновой кислоты в биологических жидкостях и тканях. Перед. Иммунол. 6 , 261 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

18. Ян, К. и др. Высоко- и низкомолекулярные формы гиалуроновой кислоты по-разному влияют на кластеризацию CD44. Дж. Биол. хим. 287 , 43094–43107 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

19. Jiang, D., Liang, J. & Noble, P.W. Гиалуронан как иммунорегулятор при заболеваниях человека. Физиол. Ред. 91 , 221–264 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

20. Pauloin, T., Dutot, M., Warnet, J.M. & Rat, P. Модуляция токсичности консервантов in vitro: гиалуронан с высокой молекулярной массой снижает апоптоз и окислительный стресс, вызванные хлоридом бензалкония. евро. Дж. Фарм. науч. 34 , 263–273 (2008).

    КАС пабмед Статья Google ученый

21. Ye, J. et al. Цитопротекторный эффект гиалуроновой кислоты и гидроксипропилметилцеллюлозы против повреждения ДНК, вызванного тимеросалом в клетках конъюнктивы Чанга. Арка Грефеса. клин. Эксп. Офтальмол. 250 , 1459–1466 (2012).

    КАС пабмед Статья Google ученый

22. Онодера, Ю., Терамура, Т., Такехара, Т. и Фукуда, К. Гиалуроновая кислота регулирует ключевой окислительно-восстановительный фактор Nrf2 посредством фосфорилирования Akt в бычьих суставных хондроцитах. FEBS Open Bio 5 , 476–484 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

23. Ву, В. и др. Защитная роль гиалуроновой кислоты при индуцированном Cr(VI) окислительном повреждении эпителиальных клеток роговицы. J. Офтальмол. 2017 , 3678586 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

24. Laurent, U.B. & Tengblad, A. Определение гиалуроновой кислоты в биологических образцах с помощью специального метода радиоанализа. Анал. Биохим. 109 , 386–394 (1980).

    КАС пабмед Статья Google ученый

25. Rouillard, A.D. et al. Harmonizome: коллекция обработанных наборов данных, собранных для предоставления и извлечения знаний о генах и белках. База данных (Оксфорд) 2016 (2016).

26. Chen, E.Y. et al. Enrichr: интерактивный и совместный инструмент анализа обогащения списка генов HTML5. БМС Биоинформа. 14 , 128 (2013).

    Артикул Google ученый

27. Ho Sui, S.J. et al. oPOSSUM: идентификация чрезмерно представленных сайтов связывания факторов транскрипции в коэкспрессируемых генах. Рез. нуклеиновых кислот. 33 , 3154–3164 (2005).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

28. Bourguignon, L.Y., Gilad, E., Rothman, K. & Peyrollier, K. Взаимодействие гиалуронана-CD44 с IQGAP1 способствует передаче сигналов Cdc42 и ERK, что приводит к связыванию актина, активации транскрипции Elk-1/рецептора эстрогена и яичникам. прогрессирование рака. Дж. Биол. хим. 280 , 11961–11972 (2005 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

29. Чжан, Л. С., Ма, Х. В., Грейнер, Х. Дж., Зуо, В. и Маммерт, М. Э. Ингибирование пролиферации клеток с помощью CD44: Akt инактивирован, а EGR-1 подавляется. Клеточный пролиф. 43 , 385–395 (2010).

    КАС пабмед Статья Google ученый

30. Miletti-Gonzalez, K. E. et al. Идентификация функции внутрицитоплазматического домена CD44 (CD44-ICD): модуляция транскрипции матриксной металлопротеиназы 9 (MMP-9) с помощью нового ответного элемента промотора. Дж. Биол. хим. 287 , 18995–19007 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

31. Фишер, М. Перепись и оценка генов-мишеней p53. Онкоген 36 , 3943–3956 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

32. Лакнер, Д. Х., Хаяши, М. Т., Чезаре, А. Дж. и Карлседер, Дж. Геномный подход определяет регуляцию экспрессии генов, специфичную для старения. Стареющая ячейка 13 , 946–950 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

33. Танака Х. и др. Ген рибонуклеотидредуктазы, участвующий в p53-зависимой контрольной точке клеточного цикла для повреждения ДНК. Природа 404 , 42–49 (2000).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Статья Google ученый

34. Оцука Т. и др. ASC представляет собой адаптер Bax и регулирует путь митохондриального апоптоза p53-Bax. Нац. Клеточная биол. 6 , 121–128 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

35. Керли-Гамильтон, Дж. С., Пайк, А. М., Ли, Н., Ди Ренцо, Дж. И Спинелла, М. Дж. Доминирующий p53 транскрипционный ответ на цисплатин при эмбриональной карциноме человека, происходящей из зародышевых клеток яичка. Онкоген 24 , 6090–6100 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

36. Джекс, Т. и др. Анализ спектра опухолей у мышей с мутацией p53. Курс. биол. 4 , 1–7 (1994).

    КАС пабмед Статья Google ученый

37. Fischer, M. Сохранение и расхождение регуляторной сети гена p53 между мышами и людьми. Онкоген 38 , 4095–4109 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

38. Кин, М. и др. Ресурс генома голых землекопов: содействие анализу рака и адаптации, связанной с долголетием. Биоинформатика 30 , 3558–3560 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

39. Suwan, K. et al. Versican/PG-M собирает гиалуронан во внеклеточный матрикс и ингибирует CD44-опосредованную передачу сигналов в направлении преждевременного старения в эмбриональных фибробластах. Дж. Биол. хим. 284 , 8596–8604 (2009 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

40. Куо, Х.Л., Хо, П.С., Хуанг, С.С. и Чанг, Н.С. В погоне за передачей сигналов с помощью трехмолекулярной покадровой FRET-микроскопии. Дисков клеточной смерти. 4 , 45 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

41. Милваганам, С. М., Гринштейн, С. и Фриман, С. А. Пикеты в плазматической мембране: функции в иммунных клетках и фагоцитоз. Семин Иммунопатол. 40 , 605–615 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

42. Уэрта-Анжелес Г., Неспорова К., Амброзова Г., Кубала Л. и Велебны В. Эффективный перевод: разработка медицинских препаратов на основе гиалуроновой кислоты с физико-химических и доклинических аспектов. Перед. биоинж. Биотехнолог. 6 , 62 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

43. Селуанов А., Вайдя А., Горбунова В. Получение первичных культур взрослых фибробластов грызунов. Дж. Виз. Эксп. 44 , 2033 (2010).

44. Донг Ю. и др. Не содержащие эндотоксинов гиалуронан и гиалуронановые фрагменты не стимулируют ФНО-альфа, интерлейкин-12 и не активируют костимулирующие молекулы в дендритных клетках или макрофагах. Науч. Респ. 6 , 36928 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

45. Биттер, Т. и Мьюир, Х.М. Модифицированная реакция карбазола уроновой кислоты. Анал. Биохим. 4 , 330–334 (1962).

    КАС пабмед Статья Google ученый

46. «>

    Лав, М. И., Хубер, В. и Андерс, С. Модерированная оценка изменения кратности и дисперсии для данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном Биол. 15 , 550 (2014).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

47. Palyi-Krekk, Z. et al. Индуцированная гиалуроновой кислотой маскировка ErbB2 и усиленная CD44 интернализация трастузумаба при резистентном к трастузумабу раке молочной железы. евро. Дж. Рак 43 , 2423–2433 (2007).

    КАС пабмед Статья Google ученый

48. Gao, C.L.S., Wang, Y., Cha, G. & Xu, X. Влияние рецептора ингибирования подвижности, опосредованного гиалуроновой кислотой, на радиочувствительность аденокарциномы легкого A549клетки. Перевод. Рак Рез. 8 , 410–421 (2019).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения США (NIH) В. Г. и в качестве. М.Т. был частично поддержан Японским обществом содействия развитию науки (JSPS) и Мемориальным фондом Уэхара.

Информация о авторе

Авторы и принадлежности

1. Департамент биологии, Университет Рочестера, Рочестер, Нью -Йорк, 14627, США

   Масаки Такасуги, Денис Фирсанов, Грегори Томблин, Юлия Аблава, Андрея -Сель -Селаун. Отделение болезней органов пищеварения, Первая дочерняя больница Университета Чжэнчжоу, Чжэнчжоу, Чжэнчжоу, Хэнань, 450052, Китайская Народная Республика

   Ханьбин Нин

Авторы

1. Масаки Такасуги

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. Денис Фирсанов

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Gregory Tombline

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

4. Hanbing Ning

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

5. Юлия Аблаева

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

6. Андрей Селуанов

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

7. Вера Горбунова

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Вклады

М. Т., А.С. и В.Г. задумал и спроектировал исследование. М.Т., Д.Ф., Г.Т., Х.Н. и Дж.А. проводил опыты. М.Т., А.С., В.Г. написал рукопись.

Авторы переписки

Переписка с Андрей Селуанов или Вера Горбунова.

Декларации этики

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Информация о рецензировании Nature Communications благодарит Robert Shmookler Reis, Spyridon Skandalis и других анонимных рецензентов за их вклад в рецензирование этой работы. Доступны отчеты о рецензировании.

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Supplementary information

Supplementary Information

Peer Review File

Supplementary Data1

Reporting Summary

source data

Source Data

Rights and permissions

Open Access Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4. 0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете первоначальных авторов и источник, а также ссылку на лицензию Creative Commons и указать, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатка и разрешения

Об этой статье

Дополнительная литература

• Содержание и размер гиалуроновой кислоты в тканях и плазме голого землекопа

  • Дельфин дель Мармоль
  • Сюзанна Хольце
  • Бруно Фламион

  Научные отчеты (2021)

Комментарии

Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Правила сообщества. Если вы обнаружите что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неприемлемое.

Борьба с ущербом от кротов и полевок

Подземная среда обитания Bathyergidae привела к эволюционной адаптации сенсорных способностей и соответствующих анатомических и нейроанатомических систем, которые необходимо учитывать при разработке и интерпретации поведенческих тестов. Традиционно поведенческие парадигмы в лабораторных условиях разрабатывались для более типичных моделей животных (например, мышей и крыс) и включали аспекты, соответствующие их зрительным и слуховым возможностям. Эти конструкции часто не применимы к более нетипичным исследовательским моделям, таким как подземный голый землекоп (9). 0023 Heterocephalus glaber ), для которых сенсорные ограничения, такие как функциональная слепота, играют роль (Hetling et al., 2005). В частности, парадигмы тестирования пространственной памяти, такие как водный лабиринт Морриса (Morris, 1984) и лабиринт с радиальными рукавами (Olton and Samuelson, 1976; Brown and Cook, 1986), часто полагаются на визуальные подсказки, которые обеспечивают основу для навигации в лабиринте. .

Разработка поведенческих задач для подземных грызунов требует учета их сенсорных способностей, отличных от других представителей Rodentia, а также включения соответствующих мотиваторов. В текущем исследовании мы разработали эффективную парадигму для изучения пространственного обучения и памяти у голых землекопов с учетом ряда факторов, которые могут повлиять на способности навигационной памяти среди членов колонии, включая возраст, пол, массу тела и ранг доминирования в пределах социальная иерархия. Мы предположили, что голые землекопы будут демонстрировать пространственное обучение в лабиринте с индивидуальной конструкцией за счет более быстрого достижения наградной камеры (уменьшенная задержка) и с оптимизированной навигацией (более короткое общее пройденное расстояние и меньшее количество совершенных ошибок) во время тренировочных испытаний, и что пространственная память будет лучше. надежный, основанный на адаптации голого землекопа к подземной среде обитания.

Материалы и методы

Животные

В этом исследовании использовали сорок три голых землекопа ( H. glaber; Rüppell, 1842) (25 самок, 18 самцов) различной массы тела и возраста. Для предварительного исследования с использованием конструкции прерывистого лабиринта использовали восемь животных (таблица 1). После усовершенствования конструкции лабиринта и включения непрерывного лабиринта было использовано тридцать пять животных. Шесть из этих животных были исключены из-за отсутствия данных для ранжирования их доминирования. У одиннадцати дополнительных животных отсутствовало не более одной контрольной точки данных. Для этих одиннадцати животных отсутствующая точка данных была заменена линейной интерполяцией. Одно дополнительное животное было исключено как выброс из-за того, что точки данных в первом обучающем испытании превышали десять стандартных отклонений от среднего, в то время как другое животное было исключено из-за смерти до окончания сбора данных. Таким образом, в исследование непрерывного лабиринта было включено 27 животных (табл. 1). Для анализа пробы памяти были исключены два дополнительных животных, одно как выброс со значениями, превышающими 10 стандартных отклонений от среднего, а другое исключено из-за отсутствия нескольких точек данных. Таким образом, 25 животных из исходных 27 были включены в анализ зонда памяти. Масса тела животных, включенных в анализ, варьировала от 23,0 до 101,0 г (компактная портативная масштабная модель Braintree Scientific CB 1001 с точностью до 0,1 г), возраст варьировал от 0,39до 6,68 лет в начале испытаний. Все голые землекопы были членами одной из двух лабораторных племенных колоний (колонии А и колонии В), которые содержались в доме, с разным статусом внутри колонии (королевы, производители, не размножающиеся). Не все члены каждой колонии были использованы. Животные были исключены на основании участия в других текущих исследованиях. В помещении вивария для каждой колонии поддерживалась температура приблизительно 27,8–30°C и относительная влажность не менее 40 %, без смены дня и ночи из-за подземной среды обитания животных (Sherman et al. , 19).91). Жилье для животных состояло из ряда камер, соединенных между собой трубками и спроектированных так, чтобы имитировать их естественную систему нор. Был обеспечен свободный доступ к еде и большому количеству постельных принадлежностей (дополнительную информацию о размещении см. в Artwohl et al., 2002). Все аспекты исследования, проведенного для этого исследования, соответствовали нашему протоколу, одобренному Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Южного Иллинойса, Карбондейл, Иллинойс, США, и соответствовали Руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию. лабораторных животных (публикации NIH № 8023 и 1978).

Таблица 1. Описательная статистика (приведенные значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего и диапазон) для голых землекопов, использованных в двух различных конструкциях пространственных лабиринтов.

Дизайн лабиринта

Мы разработали модифицированные версии лабиринта Хебба-Уильямса, распространенной парадигмы для тестирования пространственного обучения и памяти у грызунов. Модификации лабиринта Хебба-Уильямса были основаны на исследованиях, в которых использовались аналогичные тесты пространственной навигации на других нетипичных животных моделях грызунов, включая подземных туко-туко (Antinuchi and Schleich, 2003; Schleich, 2010; Brachetta et al., 2014) и слепыш слепыш (Кимчи, Теркель, 2001, 2004). Лабиринты были построены с использованием труб из ПВХ, которые были разрезаны пополам в продольном направлении и покрыты листом прозрачного акрила, создавая желоб, по которому животные могли перемещаться, и обеспечивая видимость для видеозаписи. Трубка имела диаметр 2 дюйма, такой же, как и трубка в туннельных системах жилищных камер для голых землекопов. Эта ширина трубок была выбрана на основе предыдущих исследований, которые показали более высокую эффективность обучения и памяти у слепышей при использовании более узких путей, которые обеспечивают тактильные сигналы в лабиринтах (Kimchi and Terkel, 2004).

Первый испытанный нами лабиринт был непрерывным и включал тупики (рис. 1А), аналогичные другим лабиринтам на основе Хебба-Уильямса (Kimchi and Terkel, 2001, 2004; Costanzo et al., 2009; du Toit et al. ., 2012). Для этого варианта лабиринта было проведено предварительное тестирование на когорте из восьми животных (табл. 1). Все тупики внутри лабиринта были запечатаны, а поверх лабиринта был помещен прозрачный акриловый лист, позволяющий визуализировать поведение и поведение животных в лабиринтах сверху. Камера вознаграждения состояла из цилиндрического корпуса из прозрачного литого акрила диаметром 8 дюймов, высотой 10 дюймов и толщиной стенки 1/4 дюйма. Эта наградная камера обогревалась тепловой лампой и заполнялась подстилкой из домашней колонии животного. Он был связан с лабиринтом через соединительную трубку из прозрачного литого акрила диаметром 2 дюйма с толщиной стенки 1/4 дюйма (US Plastics, артикул № 44530). Производительность измерялась с использованием задержки до камеры вознаграждения, общего расстояния, пройденного до достижения камеры вознаграждения, и количества входов в зоны ошибок. Заход в зону ошибки засчитывался, если более 50 % тела животного проходило в зону, независимо от направления входа.

Рис. 1. Конфигурации для тестирования поведения голого землекопа. (A) Модифицированный лабиринт Хебба-Уильямса с прерывистой конструкцией лабиринта, включающей тупики. Серые области обозначают области, в которых при входе была зафиксирована ошибка. (B) Модифицированный лабиринт Хебба-Уильямса с непрерывной конструкцией, лишенный тупиков и имеющий больше сходства с обширными взаимосвязанными системами подземных туннелей в среде обитания голого землекопа. (C) Тестовая установка мотиватора. Животных помещали в стартовую камеру и давали 2 мин для свободного исследования. Производительность животных тестировалась с использованием ряда мотиваторов в камере вознаграждения и сравнивалась с производительностью, когда эта камера была пуста. (D) Настройка тестирования доминирования. Животных помещали в указанные точки входа в каждую камеру, лицом друг к другу, и анализировали, сколько раз одно проходило над другим через трубку в трех испытаниях.

Голые землекопы сильно реагируют на засоры в туннелях, упорно копая и кусая в попытке преодолеть завал (Sherman et al., 1991). Во время первоначального тестирования дизайна лабиринта (рис. 1А) мы обнаружили, что это отвлечение влияет на завершение лабиринта («Частота неудач», таблица 1). Частота неудач рассчитывалась как процент обучающих попыток (испытания 1–15), в которых животные не прошли лабиринт за отведенные 5 минут (таблица 1).

FailRate(%)=IncompleteTrials/TotalTrials× 100(1)

Чтобы решить эту проблему, мы преобразовали лабиринт в непрерывную конфигурацию без тупиков (рис. 1B) и протестировали тридцать пять животных в этой конфигурации лабиринта (таблица 1). . Это позволило нам более эффективно исследовать, будут ли животные более мотивированы на прохождение лабиринта, не отвлекая внимание от поиска камеры с вознаграждением из-за тупиковых отвлекающих факторов.

Тестирование вознаграждения

Чтобы проверить эффективность ряда мотиваторов на голых землекопах и впоследствии использовать наиболее эффективный мотиватор в камере вознаграждения, перед использованием непрерывного лабиринта был проведен отдельный эксперимент. Те же самые восемь животных, которые использовались при тестировании первой конструкции лабиринта, использовались для определения подходящих мотиваторов для голых землекопов. Сначала в качестве контроля стартовую камеру соединяли с отдельной пустой камерой с помощью Г-образной соединительной трубки. Поведение каждого животного сначала оценивали в этом контрольном состоянии (см. анализ данных ниже). Чтобы проверить эффективность ряда мотиваторов, в пустую камеру добавили мотиватор, превратив ее в камеру вознаграждения (рис. 1С). Для контрольного теста каждое животное помещали в стартовую камеру и наблюдали в течение одной попытки продолжительностью 2 мин. Регистрировали время, проведенное в каждой камере, и задержку до входа в пустую камеру. Затем это сравнивали с производительностью каждого животного с мотиватором, присутствующим в камере вознаграждения. Всех животных тестировали с одним мотиватором (например, грелкой) в течение одной пробы продолжительностью 2 мин перед переключением на следующий мотиватор, а мотиваторы тестировали в следующем порядке: грелка, затемненная камера (защищенная от внешнего света черной конструкцией). бумага), еда (сладкий картофель, банановое детское питание и ProNutro — все предметы, помещенные вместе в пищевую камеру, для всех протестированных животных), подстилка для домашней колонии и подстилка для чужой колонии (таблица 2). Стартовую и пустую камеры или камеры вознаграждения протирали 70% изопропиловым этанолом между сеансами тестирования с разными животными. Полученный в результате оптимизированный мотиватор, представляющий собой комбинацию подстилки для домашней колонии и нагревательной лампы, был использован для камеры непрерывного вознаграждения в лабиринте.

Таблица 2. Оценка мотиваторов камеры вознаграждения.

Определение ранга доминирования

Ранг в социальной иерархии определялся с использованием парадигмы тестирования доминирования, смоделированной по аналогии с предыдущими исследованиями на голых землекопах (Clarke and Faulkes, 1997, 1998). Все животные, используемые в непрерывной версии лабиринта, были отмечены их идентификационными номерами на спине с использованием перманентного маркера, чтобы можно было визуально отслеживать поведение во время тестирования доминирования. Два исследователя поместили по одному голому землекопу в отдельные круглые камеры. Обе камеры были соединены через прозрачную трубку из поликарбоната. Животные были ориентированы на открытые концы трубки таким образом, чтобы они встречались лицом к лицу, когда они двигались в прямом направлении (рис. 1D). Столкновения оценивались только в том случае, если одно животное проходило над другим в пробирке. Тестовая сессия закончилась после того, как были записаны три случая поведения передачи лицом к лицу. После каждого сеанса камеры и трубки очищали 70% изопропиловым спиртом. Пары животных были созданы случайным образом, при этом ни одна пара не подвергалась более чем одному сеансу тестирования вместе. Каждое животное подвергалось как минимум трем сеансам тестирования, в каждом из которых использовалась новая пара животных.

Рейтинг доминирования был определен для животных непрерывного лабиринта с использованием ранее описанных методов с голыми землекопами (Clarke and Faulkes, 1997; Gilbert et al. , 2020). Используя расширение пакета для использования с R Studio (R Core Team, 2021 г.) для расчета рейтинга Эло (Neumann and Kulik, 2020 г.), были введены результаты каждого сеанса тестирования за несколько дней, чтобы получить рейтинг каждого отдельного тестируемого животного. Чем выше рейтинг, тем доминантнее животное.

Экспериментальная парадигма

Все испытания пространственного обучения проводились в течение одного и того же 4-часового временного блока в течение каждого дня тестирования (с 8:00 до 12:00). Все испытания проводились в ярко освещенной поведенческой комнате при температуре 18,5–21 °C и относительной влажности не менее 40 %. Животных заносили в комнату в передаточных камерах и давали им акклиматизироваться в наградной камере лабиринта в течение 5 мин. Затем животных извлекали из камеры для вознаграждения и помещали в заданную точку входа в лабиринт лицом вперед (рис. 1А, В). Голому землекопу разрешили исследовать лабиринт, пока он не достиг комнаты вознаграждения. Испытание считалось завершенным, когда прошло 5 минут или когда животное успешно переместилось в камеру вознаграждения, в зависимости от того, что наступит раньше. Если животное не могло добраться до камеры для вознаграждения до истечения 5 минут, экспериментатор осторожно направлял его в камеру после прекращения испытания, и испытание считалось неудачным. При входе в камеру с наградами у входа был установлен блок, чтобы предотвратить повторный вход в лабиринт. Животному давали 5 мин отдохнуть и исследовать камеру, после чего начиналось следующее испытание. Производительность записывалась с помощью видеокамеры (FHD 1080P, YEHOOVJIANGER) и анализировалась в режиме реального времени с использованием программного обеспечения ANY-maze (Stoelting Co., Wood Dale, IL, United States).

Животных подвергали пространственному обучению/обучению в течение трех дней подряд с пятью испытаниями в день, всего пятнадцать испытаний (рис. 2). Между каждым испытанием лабиринт очищали 70% изопропиловым спиртом, чтобы уменьшить влияние обонятельных сигналов на производительность в последующих испытаниях. После каждого дня тестирования лабиринт разбирали и промывали водой с мылом без запаха. Сохранение пространственной памяти тестировали через 1 день и 1 неделю после последнего дня обучения для прерывистого лабиринта и через 1 день, 1 неделю и 1 месяц для непрерывного лабиринта (рис. 2). В дни проб памяти животное свободно исследовало лабиринт в течение одной попытки продолжительностью 5 минут или до тех пор, пока не достигало камеры вознаграждения, в зависимости от того, что произошло раньше. В испытаниях с памятью камера вознаграждения содержала те же мотиваторы, что и в испытаниях на обучение. Если животное не могло пройти лабиринт в течение отведенных 5 минут, его возвращали в колонию без направления в камеру вознаграждения.

Рис. 2. Хронология пространственного обучения и тестирования памяти. Как для прерывистого лабиринта, так и для непрерывного лабиринта животные подвергались 3-дневной поведенческой тренировке, состоящей из пяти проб в день. Через один день, 1 неделю и 1 месяц после последнего дня обучения животные подвергались однократному испытанию памяти. * Испытание пробы памяти в течение одного месяца проводилось для непрерывного лабиринта, но не проводилось для прерывистого лабиринта из-за отсутствия кривой обучения (см. рис. 6).

Анализ данных

Парная выборка t — тесты были впервые использованы для изучения эффективности различных мотиваторов для использования в камере вознаграждения. P -значения были сначала рассчитаны с использованием необработанных значений для сравнения задержки в камере вознаграждения и задержки в пустой камере (рис. 3А), а также времени пребывания в камере вознаграждения и времени пребывания в пустой камере (рис. 3В). Соотношение времени ожидания для вознаграждения (DTR _R ) и условия контроля с пустой камерой (DTR _E ) были рассчитаны следующим образом, где DT _S представляет собой время пребывания в стартовой камере с вознаграждением (DT _SR ) по сравнению с контрольными условиями с пустой камерой (DT _SE ), а DT представляет время пребывания в финишной камере между контролем (DT _E , время пребывания в пустой камере) и условиями вознаграждения (DT _R , время пребывания в награде камера):

DTR=R(DT-S⁢RDT)R/DTS⁢R

DTR=E(DT-S⁢EDT)E/DTS⁢E

Рисунок 3. Эффективность различных мотиваторов для голых землекопов. (A) Из протестированных мотиваторов подстилка для домашней колонии, подстилка для чужой колонии и тепло приводили к самым коротким задержкам входа в камеру вознаграждения по сравнению с пустой камерой. (B) Подстилка как для домашней, так и для чужой колонии привела к наибольшему увеличению времени пребывания в камере вознаграждения по сравнению со стартовой камерой. (C) При оценке коэффициента времени пребывания животные проводили относительно больше времени в камере вознаграждения по сравнению с камерой запуска, когда присутствовала либо домашняя, либо чужая подстилка для колонии. Отрицательный процент указывает на большее время, проведенное в камере вознаграждения, чем в начальной камере. *Указывает на значительную ( p < 0,05) разницу со значением для пустой камеры. с, секунды.

Для DTR _R по сравнению с DTR 9 также был проведен парный тест t .0085 E (рис. 3C). Бонферрони исправил p значений, которые использовались для определения значимости. Сводные результаты парной выборки t -тестов можно найти в таблице 2.

Для непрерывного лабиринта были проанализированы задержка до камеры вознаграждения и пройденное расстояние для изучения пространственного обучения и производительности памяти (анализ адаптирован из Vallianatou et al. др., 2020). Для животных с отсутствующими точками данных в одном испытании недостающие точки были линейно интерполированы путем усреднения значений для испытания, предшествующего отсутствующей точке, и испытания, следующего за отсутствующей точкой (например, точка данных испытания 4 была интерполирована путем усреднения значений животное в испытании 3 и испытании 5). Чтобы исследовать различия в фазе обучения в непрерывном лабиринте, мы использовали два разных многомерных факторных MANOVA с повторными измерениями. Эти модели включали массу тела и возраст как ковариаты; пол и колония как фиксированные факторы; латентность и расстояние как зависимые меры. Эти модели использовались для определения любых основных воздействий или взаимодействий на производительность аналогично предыдущим исследованиям (Costanzo et al., 2009).; Oosthuizen и др., 2013; Остуйзен, 2020). В первых повторных измерениях MANOVA использовала как «День», так и «Испытание» в качестве внутрисубъектных факторов, при этом каждый день был разделен на соответствующие 5 испытаний. Вторая модель использовалась для простоты интерпретации и моделировала только Испытания без разделения по дням. Во второй модели испытания были проанализированы как испытания с 1 по 15, а не с 1 по 3, каждое с испытанием с 1 по 5. Расчетные предельные средние значения и доверительные интервалы из этих моделей использовались для построения графика скорректированных значений производительности (см. рис. 5, 6). Эти модели с поправкой на ковариаты для массы тела = 54,60 г и возраста = 2,9.4 года. Повторное измерение MANOVA также проводилось отдельно для каждой колонии, чтобы включить рейтинг доминирования в качестве ковариации. Эти анализы, специфичные для колоний, были проведены, потому что между животными из разных колоний нельзя проводить тестирование доминирования, поскольку это тестирование приводит к смертельным столкновениям. В моделях для конкретных колоний в качестве ковариант использовались масса тела, возраст и ранжирование доминирования; секс как фиксированный фактор; латентность и расстояние как зависимые меры. Эти анализы также были выполнены двумя отдельными способами: один с двумя повторными измерениями «День» и «Испытание», а второй с «Испытаниями» в качестве единственного внутрисубъектного фактора. Колония Расчетные предельные средние значения были рассчитаны с использованием: Масса = 54,63 г, Возраст = 2,35 года, Ранг = 957.40. Расчетные предельные средние значения для колонии B были рассчитаны с использованием: масса = 54,56 г, возраст = 3,49 года, ранг = 1002,96. Все вышеупомянутые статистические анализы также проводились как отдельные повторные измерения ANOVA со скоростью в качестве зависимой переменной для дополнения анализа латентности и расстояния. Эти модели проводились отдельно, поскольку скорость равна расстоянию, деленному на задержку. Поправку Бонферрони использовали для апостериорных попарных сравнений для всех эффектов дня и испытания.

Проценты производительности в испытаниях памяти были рассчитаны для обеих конфигураций лабиринта (непрерывной и непрерывной), сравнивая производительность (латентность и пройденное расстояние) от отдельных дней проверки памяти до последнего дня обучения. Задержка и пройденное расстояние были проанализированы как для непрерывного, так и для прерывистого дизайна лабиринта, тогда как ошибки были проанализированы только для прерывистого дизайна лабиринта. Они были рассчитаны таким образом, что значение из испытания памяти (1, 2 или 3) было разделено на испытание в последний тренировочный день (испытание 5 в тренировочный день 3; рисунок 2 и таблица 3). MANOVA с повторными измерениями, в котором показатели задержки и расстояния используются в качестве зависимых показателей; масса тела и возраст как ковариаты; пол и колония как фиксированные факторы; и испытание памяти (1, 2 или 3) как внутрисубъектный фактор. Этот анализ проводился для каждой колонии отдельно и в совокупности. Этот набор статистических анализов для пробных испытаний памяти также был проведен как повторные измерения ANOVA со скоростью в качестве зависимой переменной вместо задержки и расстояния.

Таблица 3. Сравнение производительности между обеими конфигурациями лабиринта для оценки пространственной памяти.

Результаты

Проверка относительной эффективности ряда поведенческих мотиваторов у голых землекопов

Мы протестировали различные мотиваторы, чтобы оптимизировать последующую производительность тестирования в пространственном лабиринте (рис. 1C). При использовании парных тестов t для исходных значений латентности, времени пребывания и соотношения времени пребывания по сравнению с пустой камерой аналогичные мотиваторы оказались значительными (таблица 2 и рисунок 3). Латентный период усиливался при наличии подстилки домашней колонии [ t (7) = 5,904, p = 0,003] или залегание инородных колоний [ t (7) = 5,352, p = 0,005], с приближением тепла к значимости [ t (7,) = 3,21 р = 0,075]. Отношение времени пребывания не было значимым для любого тестируемого мотиватора, но время пребывания было значительно больше, когда подстилка домашней семьи [ t (7) = -9,623, p <0,001] или подстилка иностранной семьи [ t (7) = −7,904, p < 0,001] присутствовали в наградной камере. Основываясь на этих наборах анализов, тепло и наличие любого типа постельных принадлежностей (иностранные или домашние) были наиболее эффективными мотиваторами при независимом представлении. Таким образом, и тепло, и домашняя подстилка были выбраны для камеры вознаграждения в последующем непрерывном тестировании лабиринта. Подстилка для чужой колонии, хотя и также эффективная, не была выбрана из-за потенциального риска нападения на экспериментальное животное при повторном введении в домашнюю колонию из-за запаха злоумышленника (Braude et al., 2021).

Пространственное обучение у голых землекопов

Для предварительного набора данных, собранных с использованием дизайна прерывистого лабиринта ( n = 8; рис. 1A), кривые обучения не были очевидны в ходе обучающих испытаний для задержки в камере вознаграждения ( Рисунок 4A), общее количество сделанных ошибок (неправильных поворотов) (Рисунок 4B) или общее пройденное расстояние (Рисунок 4C). Частота отказов также была высокой (таблица 1). Плохая работа голых землекопов в этой прерывистой конструкции лабиринта, наряду с наблюдением, что прерывистая конструкция лабиринта могла создать путаницу (т. землекопы для демонстрации пространственного обучения и улучшения памяти), привели нас к перепроектированию лабиринта в виде непрерывной схемы без тупиков.

Рис. 4. Непрерывное обучение в пространственном лабиринте у голых землекопов. Предварительные данные были собраны ( n = 8) с использованием прерывистой модифицированной версии лабиринта Хебба-Вильямса (см. рис. 1А) для исследования возможностей пространственного обучения и памяти у голых землекопов в ходе 15 тренировочных испытаний (5 испытаний в день). на 3 дня). (A) Задержка достижения камеры вознаграждения усреднялась по животным для каждого испытания обучения/обучения. Непрерывное выполнение лабиринта показало очень постепенную кривую обучения задержки с тенденцией к уменьшению задержки в испытаниях, но большую вариабельность в индивидуальной производительности. (B) Среднее количество входов в зону ошибки было нанесено на график для всех животных, протестированных в ходе испытаний по обучению/обучению. Для прерывистого лабиринта не было кривой обучения уменьшению ошибок. (C) Общее расстояние, пройденное до достижения камеры вознаграждения, усреднялось по животным для каждого испытания и наносилось на график для всех испытаний обучения/обучения. Непрерывное прохождение лабиринта показало большую вариабельность индивидуальной производительности и отсутствие кривой обучения, связанной с уменьшением пройденного расстояния (оптимизация пути к камере вознаграждения). м, м; с, секунды.

Рис. 5. Эффективность обучения в непрерывном пространственном лабиринте у голых землекопов. Данные были собраны ( n = 27) с использованием конструкции непрерывного лабиринта (см. рис. 1B) для исследования пространственного обучения и возможностей памяти у голых землекопов в ходе 15 тренировочных испытаний (5 испытаний в день в течение 3 дней). (A) Средняя задержка в камере вознаграждения выявила четкую кривую обучения в ходе испытаний по обучению/обучению. Сравнение испытания 1 с испытаниями 2–15 выявило значительное снижение латентности в испытании 3. (B) Среднее общее пройденное расстояние также продемонстрировало кривую обучения в процессе обучения/учебных испытаний. Сравнение испытания 1 с испытаниями 2–15 выявило значительное уменьшение расстояния в испытании 3. (C) Средняя пройденная скорость значительно увеличилась во время тренировочных испытаний в испытании 6. * p < 0,05 по сравнению с испытанием 1. м, метров; с, секунды.

Рис. 6. Непрерывные кривые обучения пространственного лабиринта с использованием расчетных предельных средних значений. (А) Задержка в камере вознаграждения была значительно уменьшена в среднем в испытаниях 2, 3, 4 и 5 по сравнению с испытанием 1 в дни 1–3, демонстрируя основной эффект испытания независимо от дня задержки. (B) Средняя задержка для каждого дня обучения показала, что животные добирались до камеры вознаграждения за значительно меньшее время в дни 2 и 3 по сравнению с днем ​​1. (C) Животные продемонстрировали значительный эффект обучения при сравнении расстояния, пройденного в испытаниях 2. , 3 и 5 по сравнению с испытанием 1 в дни 1–3, демонстрируя основной эффект испытания, не зависящий от дня, для расстояния. (D) Животные прошли значительно меньшее расстояние в день 2 по сравнению с днем ​​1. Коварианты, появляющиеся в модели, оценивались по следующим значениям: масса = 54,60, возраст = 2,94.* p < 0,05. м, м; с, секунды.

Обе колонии (колония A и колония B) были проанализированы вместе на максимальную мощность с дизайном непрерывного лабиринта ( n = 27; рис. 1B) и с использованием повторных измерений MANOVA, которые не моделировали эффект тестирования в отдельные дни. для простоты интерпретации. Этот анализ выявил четкую кривую обучения в 15 тренировочных испытаниях (рис. 5А), которая отсутствовала в прерывистом лабиринте. Отмечалось многофакторное влияние количества проб на производительность [9].0023 F _{(28, 588)} = 3,074, p < 0,001, рисунок 5А и дополнительная таблица 1]. Многофакторный эффект Trial был обусловлен основными эффектами как задержки, так и расстояния. Повторные попарные сравнения испытаний 1 с испытаниями 2–15 показали, что задержка ( с поправкой Бонферрони p <0,05, рисунок 5A и дополнительная таблица 1) и расстояние ( с поправкой Бонферрони p <0,05, рисунок 5B и дополнительная таблица 1) значительно уменьшились. к 3-й попытке, тогда как скорость значительно увеличилась к 6-й попытке (Бонферрони исправил p <0,05, рисунок 5C и дополнительная таблица 3). Кроме того, у самок животных было значительно большее увеличение скорости обучения, чем у самцов [ F _{(14, 294)} = 2,811, p = 0,001, дополнительная таблица 3], хотя существенных различий между полами не было. для задержки и расстояния между испытаниями.

При использовании модели, которая включала в себя отдельные дни тестирования, были получены аналогичные результаты. Наблюдался многомерный эффект Trial [ F _{(8, 168)} = 3,732, p < 0,001, дополнительная таблица 2], обусловленный значительными основными эффектами испытания на обе задержки [ F _{(4, 84)} = 5,494, , , , , = 0,001, дополнительная таблица 2] и расстояние [ F _{(4, 84)} = 2,809, p = 0,031, дополнительная таблица 2], но не скорость [ F _{(4, 84)}

6 = , p = 0,051, дополнительная таблица 4]. Парные сравнения с поправкой Бонферрони показали, что животные путешествовали значительно меньше во время испытаний 2, 3 и 5 в любой день по сравнению с испытанием 1 (-1,888, -2,4843, -1,9).10 и −2,574 м соответственно; р < 0,05; Рисунок 6C и дополнительная таблица 2). Точно так же задержка значительно уменьшилась от испытания 1 до испытаний 2, 3 и 5 (соответствующие изменения -43,515, -61,82 и -72,84 с; p <0,05; рисунок 6A и дополнительная таблица 2).

Не было многомерного эффекта Day, независимо от номера испытания. Также не было выявлено одномерного основного влияния Дня на задержку, скорость или расстояние, пройденное для достижения камеры вознаграждения. Однако попарные сравнения показали, что расстояние значительно уменьшилось между 1 и 2 днями тренировки (-1,768 м, Бонферрони исправил 9).0023 р = 0,002; Рисунок 6D и дополнительная таблица 2). Не было значительного уменьшения расстояния между пройденным расстоянием в 1-й и 3-й дни тренировки. Средняя задержка между испытаниями в 1-й день периода обучения была значительно больше, чем латентность во 2-й день (70,376 с, p <0,05; рисунок 6B и дополнительная таблица 2) и в 3-й день (76,556 с, p <0,05); Рисунок 6B и дополнительная таблица 2).

Было значимое многомерное взаимодействие Day by Trial [ F _{(16, 36)} = 3,534, p < 0,001, дополнительная таблица 2], обусловленные значительным взаимодействием для обеих задержек [ F _{(8, 168)} = 6,006, p <дополнительной таблицы

2] и расстояние [ F _{(8, 168)} = 4,084, p <0,001, дополнительная таблица 2]. Также наблюдалось значительное взаимодействие Day и Trial по скорости [ F _{(8, 168)} = 2,40, p = 0,018, дополнительная таблица 4]. Как задержка, так и расстояние продемонстрировали наибольшие улучшения производительности в испытаниях в первый день обучения, при этом улучшения производительности стабилизировались в испытаниях в дни 2 и 3, показывая, что большая часть обучения происходила в день 1.

Не было многомерного взаимодействия между днем ​​и массой тела, однако было одномерное влияние на латентность [ F _{(2, 42)} = 4,137, p = 0,023, дополнительная таблица 2], но не на расстояние . Более крупные животные имели более высокие задержки, чтобы добраться до камеры вознаграждения в первые дни обучения, и эти различия уменьшались в течение дня, несмотря на то, что все животные преодолевали сопоставимые расстояния.

Отсутствовало многовариантное взаимодействие Trial by Age. Однако было выявлено одномерное влияние Испытания по возрасту на расстояние [ F _{(4, 84)} = 2,580, p = 0,043, дополнительная таблица 2], что указывает на лучшую производительность для более молодых животных в испытаниях 2 и 3, но для более старых животных в испытаниях 4 и 5. многомерный трехсторонний день по испытанию по взаимодействию с массой тела [ F _{(16, 336)} = 1,988, p = 0,013, дополнительная таблица 2], обусловленный значительными взаимодействиями по обеим задержкам [ F _{(8, 168)} = 3,245, p = 0,002, дополнительная таблица 2] и расстояние [ F _{(8, 168)} = 2,398, p = 0,018, дополнительная таблица 2]. Этот эффект указывал на то, что на форму кривой обучения по дням и испытаниям влияла масса тела: более мелкие животные изначально демонстрировали более быстрое обучение, с более изменчивыми результатами в более поздних тренировочных испытаниях.

Не было ни многомерного воздействия Day by Trial by Sex на производительность, ни одномерного воздействия на задержку и расстояние. Однако имело место значительное трехстороннее одномерное взаимодействие по скорости. Самки животных увеличивали скорость во время обучающих испытаний значительно больше, чем самцы [9].0023 F _{(8, 168)} = 3,443, p = 0,001, дополнительная таблица 4].

Никакие другие многомерные или одномерные эффекты или взаимодействия (день по возрасту, день по полу или день по колонии, испытание по массе, испытание по полу и испытание по колонии) не были значительными для задержки достижения наградной камеры, пройденного расстояния, или скорость.

Чтобы включить рейтинг доминирования (специфический показатель колонии) в GLM, набор данных был разделен по колониям для анализа. Не было значительного влияния ранга доминирования на задержку или расстояние между испытаниями и днями, а также не было никаких взаимодействий ранга доминирования с какими-либо другими переменными в модели (подробную статистику см. в дополнительных таблицах 1, 2). Скорость передвижения варьировалась в зависимости от ранга доминирования для колонии B, при этом подчиненные животные перемещались быстрее в испытаниях, чем доминирующие животные (подробную статистику см. в дополнительных таблицах 3, 4).

Эти результаты показывают, что голые землекопы демонстрировали значительное пространственное обучение в непрерывном лабиринте. Основная часть улучшений производительности произошла в течение первых 3 испытаний, что указывает на быстрое пространственное обучение. Расчеты как задержки, так и расстояния были информативны при оценке результатов пространственного обучения в этой конкретной конфигурации лабиринта у голых землекопов, что позволяет предположить, что голые землекопы смогли быстро научиться ориентироваться в непрерывном дизайне лабиринта.

Пространственная память у голых землекопов

Средняя производительность была проанализирована в тестах памяти как для прерывистого лабиринта, так и для непрерывного лабиринта (таблица 3). Не было никаких существенных различий между последним испытанием в последний учебный день и испытаниями памяти 1, 2 или 3 в оценке латентного периода (рис. 7А) или пройденного расстояния (рис. 7В), а также каких-либо влияний возраста, пола, ранжирования, или масса. Это свидетельствует о том, что пространственная память сохранялась у голых землекопов не менее 1 мес.

Рисунок 7. Производительность памяти в непрерывном пространственном лабиринте у голых землекопов. Животных тестировали на сохранение пространственной памяти через 1 день, 1 неделю и 1 месяц (проба памяти 1, 2 и 3 соответственно) после обучения. Пунктирные линии показывают точку эквивалентности результатов в последний тренировочный день. (A) Задержка между испытаниями проб памяти, при этом показатели задержки пробы памяти показаны в процентах от последней попытки в последний день обучения на этапе обучения тестирования. Никаких существенных различий не было обнаружено, что указывает на сохранение пространственной памяти, хотя это могло быть искажено присутствующей высокой изменчивостью. (B) Общее расстояние, пройденное в ходе испытаний проб памяти, при этом расстояние, пройденное во время указанного испытания пробы памяти, показано в процентах от расстояния, пройденного во время последней попытки последнего тренировочного дня. Никаких существенных ухудшений производительности не было отмечено в течение трех временных точек.

Обсуждение

В ходе настоящего исследования был создан индивидуальный и эффективный дизайн лабиринта для тестирования пространственного обучения и памяти у голых землекопов. Мы предсказали, что животные будут демонстрировать пространственное обучение, достигая камеры вознаграждения быстрее (уменьшается задержка) и более искусно (более короткое общее пройденное расстояние и / или меньше совершенных ошибок, что указывает на оптимизированную навигацию по лабиринту) во время тренировочных испытаний. Это приведет к крутым кривым обучения и резким плато при достижении пиковой производительности. Чтобы эффективно создать лабиринт для оценки этих показателей обучения и памяти, мы внесли целевые изменения в конструкцию лабиринта Хебба-Уильямса для использования у голых землекопов на основе их уникальных сенсорных систем.

Голые землекопы функционально слепы, с низкой остротой зрения, но с некоторыми остатками светочувствительности. Оливарное претектальное ядро, область, участвующая в обнаружении света, мала, но сохраняет свою типичную морфологию (Crish et al. , 2006). В сочетании с сохраненной реакцией сужения зрачков на свет, в дополнение к поведенческим реакциям на обнаружение света (например, замирание при внезапном изменении яркости), голые землекопы сохраняют способность обнаруживать изменения интенсивности света (Hetling et al., 2005). но в остальном слабовидящие. Считается, что такое снижение зрительных возможностей сохраняет сенсорные ресурсы в пользу других модальностей (например, тактильных), которые более полезны в подземных туннельных системах, в которых отсутствует множество значимых визуальных сигналов, которые облегчили бы такие действия, как навигация. Поскольку традиционные протоколы для пространственных лабиринтов используют визуальные подсказки, были необходимы корректировки, чтобы приспособиться к дефициту зрения у голых землекопов.

Подземная среда обитания голого землекопа, как полагают, также привела к снижению слуховых способностей. Голые землекопы наиболее чувствительны к частотам от 65 до 12,8 кГц (Heffner, Heffner, 1993; Okanoya et al. , 2018). Голые землекопы демонстрируют плохую локализацию звука в дополнение к меньшим слуховым ядрам ствола мозга, связанным с бинауральной обработкой высокочастотного звука (Heffner and Heffner, 1993). Их улитки характеризуются менее обширной спиральностью (Mason et al., 2016). Эти особенности, наряду с дифференциальными вариациями плотности волосковых клеток в улитке (Barone et al., 2019), все возможные вклады в продемонстрированные у этого вида плохие способности к локализации звука (Heffner and Heffner, 1993). Из-за относительно ограниченных слуховых возможностей голых землекопов слуховые стимулы не были включены в конструкцию пространственного лабиринта, чтобы помочь животным добраться до камеры вознаграждения.

В отличие от слуховой и зрительной систем соматосенсорная система голых землекопов хорошо развита и включает в себя массив осязательных волосков, распределенных по всему телу и лицу (Crish et al., 2003; Henry et al., 2006). ). Имея около 40 тактильных волосков на каждой стороне тела, голые землекопы демонстрируют сильные ориентировочные реакции на стимуляцию отдельных волосков (Crish et al. , 2003). Эти сенсорные волоски также присутствуют у некоторых представителей Bathyergidae (Bennett and Jarvis, 2004; Bennett et al., 2009).; Walcher et al., 2018), предоставляя сенсорную информацию, компенсирующую нарушения зрения у подземных грызунов (Jarvis and Bennett, 2017). Основываясь на этих сенсорных специализациях, мы построили пространственный лабиринт с трубками, которые были достаточно узкими, чтобы стимулировать тактильные волоски и давать пространственные сигналы. Предыдущие исследования на слепых землекопах продемонстрировали повышение эффективности обучения и памяти при использовании столь же узких проходов, которые давали тактильные сигналы в пространственных лабиринтах (Kimchi and Terkel, 2004).

На этапе предварительного сбора данных в этом исследовании мы первоначально реализовали модифицированный дизайн лабиринта Хебба-Уильямса, который был прерывистым (рис. 1А). Однако эта конструкция лабиринта оказалась неэффективной в выявлении истинных способностей к пространственному обучению и памяти у голых землекопов, и при тестировании животных в прерывистом лабиринте не было выявлено никаких кривых обучения (рис. 6). Это может быть связано с отвлечением внимания от тупиков туннеля. Голые землекопы предпочитали копать или прокусывать тупики туннеля, а не искать камеру с вознаграждением, что сильно влияло на показатели пространственного обучения и памяти (например, латентность) в дополнение к влиянию на завершение процесса. лабиринт в течение отведенного времени (т. е. частота неудач, таблица 1). Эти поведенческие наблюдения подтверждаются предыдущими исследованиями, показавшими, что голые землекопы очень заинтересованы в удалении любых блокировок в своих туннельных системах (Brett, 19).91).

Основываясь на результатах прерывистого лабиринта, мы исследовали мотиваторы, которые хорошо работали бы в паре с совпадающими желаниями кусать и копать в условиях туннеля. Как правило, пространственные лабиринты полагаются на пищевые вознаграждения, чтобы мотивировать животных пройти лабиринт (Олтон и Самуэльсон, 1976; Браун и Кук, 1986; дю Туа и др., 2012). Однако структура колонии голых землекопов затрудняет лишение животных пищи без постоянной изоляции от их колонии, а это, в свою очередь, может отрицательно сказаться на поведенческих характеристиках. Таким образом, необходимо было разработать альтернативные методы мотивации. Голые землекопы были классифицированы как пойкилотермы — плохие регуляторы собственной температуры тела (Яхав и Баффенштейн, 19).92), но это зависит от их состояния активности, и поэтому их можно более точно охарактеризовать как гетеротермические (Kovalzon et al., 2020, 2021). Поэтому в наградную камеру в качестве мотиватора была добавлена ​​тепловая лампа (таблица 2 и рисунок 3). Как роющие грызуны, животные быстро проникали в камеру с вознаграждением, когда подстилка присутствовала, и сразу же начинали копаться в ней и пинать ее по камере. Поскольку домашние и чужие подстилки для колонии оказались эффективными мотиваторами (таблица 2 и рисунок 3), мы включили комбинацию подстилки для домашней колонии и нагревательной лампы в наградной камере для последующего тестирования в лабиринте, подтверждая предыдущие исследования, показывающие желательность домашней подстилки. (О’Риэн и Джарвис, 19 лет.97; Диакон, 2012; Тор и др. , 2015). Подстилка для чужеродных колоний, хотя и эффективная для увеличения времени, проведенного в камере вознаграждения, и уменьшения задержки в камере вознаграждения, была признана неоптимальной и не использовалась в последующем тестировании лабиринта. Это решение было основано на территориальном характере голых землекопов (O’Riain and Jarvis, 1997; Braude et al., 2021) и риске нападения на экспериментальное животное при реинтродукции в домашнюю колонию из-за запаха незваного гостя. .

В нашей переработанной непрерывной версии лабиринта Хебба-Уильямса не было тупиков, которые голые землекопы могли бы интерпретировать как закупорку их туннельных систем (рис. 1В), что привело к снижению частоты отказов (Таблица 1). В отличие от прерывистого лабиринта (рис. 4А), кривые обучения были очевидны в непрерывном лабиринте (рис. 5А). При использовании MANOVA с повторными измерениями как задержка, так и расстояние в испытаниях обучения показали значительные кривые обучения в зависимости от испытаний и дней (рис. 5A, B). Таким образом, текущее исследование продемонстрировало пространственное обучение у голых землекопов с использованием индивидуальной конструкции непрерывного лабиринта с задержкой до камеры вознаграждения и пройденным расстоянием в качестве показателей обучения. Более мелкие животные продемонстрировали более быстрое обучение (дополнительные таблицы 1, 2). Не было многомерного эффекта «День за испытанием по возрасту». Общее влияние возраста на производительность может быть уменьшено из-за сравнительно небольшого возрастного диапазона, проверенного в текущем исследовании (примерно 7 лет), по сравнению с более чем 30-летней продолжительностью жизни содержащихся в неволе голых землекопов (Buffenstein and Craft, 2021; Buffenstein et al. др., 2022). В Day by Trial by Sex взаимодействия ни латентность, ни расстояние между полами существенно не различались. Одно из возможных объяснений отсутствия влияния пола на пространственное обучение и память состоит в том, что эти различия будут присутствовать у видов с половыми различиями в домашних ареалах (Costanzo et al. , 2009).), чего у наших голых землекопов нет из-за общей системы нор для самцов и самок. Не было значительного влияния рейтинга доминирования (дополнительные таблицы 1, 2), несмотря на предыдущие публикации, показывающие влияние социальной иерархии на пространственную память (Costanzo et al., 2009).

При использовании повторных измерений MANOVA-анализа для анализа сохранения в памяти прироста пространственного обучения значительное снижение производительности памяти не было очевидным. Это указывает на хорошее сохранение памяти в течение по крайней мере 1 месяца (таблица 3 и рисунок 7), однако важно отметить, что мотиваторы присутствовали в камере вознаграждения во время испытаний проб памяти, и животные могли следовать сенсорным сигналам, а не явно. используя пространственную память. Эти результаты подтверждаются предыдущими исследованиями, показывающими, что другие виды землекопов не испытывали снижения производительности/удержания пространственной памяти в течение 1 месяца после обучения, превосходя более дальних родственников внутри Rodentia, крысу и степную полевку (Кимчи и Теркель, 2001).

Заключение и дальнейшие направления

Результаты этого исследования позволяют по-новому взглянуть на соображения, которые необходимо учитывать при разработке поведенческих тестов для атипичных моделей животных. При проведении поведенческого тестирования представителей Bathyergidae важно создавать задачи, соответствующие их эволюционным адаптациям. Это включает в себя изменение традиционных настроек лабиринта с учетом сенсорных возможностей и подземных специализаций. Кроме того, возможно, потребуется включить нетипичные мотиваторы (например, домашнюю подстилку) и удалить конкурирующие и мешающие мотиваторы (например, туннельные тупики), чтобы оптимизировать выполнение вида в поведенческой задаче и получить истинное представление о способности пространственного обучения и памяти вида. В частности, для голых землекопов использование нагревательной лампы в сочетании с домашней подстилкой в ​​​​камере вознаграждения эффективно заменило типичные мотиваторы (еда или жидкое вознаграждение после лишения пищи), которые не идеальны для животных в структуре социальной колонии, где изоляция может оказаться вредной. . Потому что H. glaber имеет много поведенческих и анатомических отличий от других батиергид, методы, используемые в текущем исследовании, вероятно, потребуют определенных модификаций, чтобы оптимизировать пространственное обучение и тестирование памяти для других представителей Bathyergidae.

Очевидный эффект пола был очевиден в крутой кривой обучения, связанной с непрерывным тестированием лабиринта у голых землекопов, но задержка и расстояние оказались эффективными мерами пространственного обучения (рис. 5). Кроме того, приобретенное пространственное обучение сохранялось не менее 1 месяца (рис. 7). В будущих исследованиях дизайн непрерывного лабиринта, который мы разработали, выиграет от повышенной сложности, чтобы лучше проверить степень пространственного обучения и памяти. Дальнейшие временные точки (например, 2 месяца, 6 месяцев, 1 год) и сравнение показателей проб памяти с наличием мотиваторов и без них в камере вознаграждения могут помочь выяснить истинную степень сохранения пространственной памяти у голых землекопов, в дополнение к определяющие факторы, которые могут повлиять на потерю памяти.

Это исследование закладывает основу для будущих поведенческих тестов, которые будут разработаны в помощь поступательным исследованиям, таким как использование голых землекопов в нейродегенеративных исследованиях (Markey et al., 2015) или изучение нарушений пространственного обучения и памяти после потери зубов ( Okamoto et al., 2010; Chen et al., 2018; Lin et al., 2020), в дополнение к фундаментальным научным исследованиям, посвященным эволюционным адаптациям, характерным для роющих грызунов (Edrey et al., 2011; Smith et al., 2015). ; Граймс и др., 2017). Учитывая уникальную адаптацию сенсорных систем у батиергид, будущие исследования их поведенческого использования специализированных чувств, таких как магнитная ориентация (Oliveriusová et al., 2012), могут дать ценную информацию о том, как эти системы способствуют обучению и производительности памяти.

Заявление о доступности данных

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Южного Иллинойса, Карбондейл, Иллинойс, США.

Вклад авторов

NH и DS внесли свой вклад в экспериментальный дизайн. NH и LA собрали данные для исследования. NH и KS проанализировали данные. NH, KS и DS интерпретировали данные. NH подготовил рисунки рукописи. NH и DS подготовили рукопись с исправлениями, внесенными NH, LA, KS и DS. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все утверждения, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Грегори Роуза за его неоценимый вклад в дизайн исследования и рецензентов за их полезные отзывы, которые значительно улучшили эту рукопись.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2022.879989/full#supplementary-material

Ссылки

D. Antinuchi, C. Antinuchi, C. и Шлейх, CE (2003). «Пространственная память у одиночного подземного грызуна Ctenomys talarum (rodentia: ctenomyidae)». Бел. Дж. Зул. 133, 89–91.

Google Scholar

Artwohl, J., Hill, T., Comer, C., и Park, T. (2002). «Голые землекопы: уникальные возможности и проблемы содержания». Лабораторное животное 31:32. doi: 10.1038/5000156

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Бароне К. М., Дума С., Рейнтьес Д.О.Дж., Броу Б.М., Кеппль К., Кламп Г. и др. (2019). «Измененная кохлеарная иннервация у развивающихся и половозрелых голых и дамараландских землекопов». J. Сравнительный анализ. Нейрол. 527, 2302–2316. doi: 10.1002/cne.24682

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Bennett, NC, and Jarvis, JUM (2004). ‘Криптомис дамаренсис’. Млекопитающее. Вид 756:1. doi: 10.1644/756

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bennett, N.C., Faulkes, C.G., Hart, L., and Jarvis, JUM (2009). «Bathyergus suillus (rodentia: Bathyergidae)». Млекопитающее. Оксфордский университет 828, 1–7. дои: 10.1644/828.1

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Google Scholar

Брачетта, В., Шлейх, К.Э., и Зенуто, Р.Р. (2014). «Влияние острого и хронического воздействия сигналов хищников на способности к пространственному обучению у подземных грызунов Ctenomys talarum (rodentia: ctenomyidae)». Этология 120, 563–576. doi: 10.1111/eth.12230

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Брауде С., Хесс Дж. и Ингрэм К. (2021). «Межколониальная инвазия между колониями диких голых землекопов». Дж. Зул. 313, 37–42. doi: 10.1111/jzo.12834

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Бретт, Р. А. (1991). «Экология колоний голых землекопов: рытье нор, пища и ограничивающие факторы», в The Biology of the Naked Mole-Rat , eds PW Sherman, JUM Jarvis и RD Alexander (New Jersey: Princeton University Press), 137. –184.

Google Scholar

Браун, М. Ф., и Кук, Р. Г. (1986). «Внутрииспытательная динамика производительности лабиринта с радиальными рукавами у крыс». Учиться. Мотивировать. 17, 190–205. doi: 10.1016/0023-9690(86)-X

CrossRef Full Text | Google Scholar

Баффенштейн Р., Аморозо В., Андзиак Б., Авдеев С., Азпуруа Дж., Баркер А. Дж. и др. (2022). «Голая правда: всестороннее разъяснение и классификация современных «мифов» в биологии голого землекопа». Биол. Ред. 97, 115–140. doi: 10.1111/brv.12791

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Баффенштейн Р. и Крафт В. (2021). «Идиосинкразические физиологические черты голого землекопа; устойчивая животная модель старения, долголетия и продолжительности здоровья». Доп. Эксп. Мед. биол. США 1319, 221–254. doi: 10.1007/978-3-030-65943-1_8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен Дж., Рен С. Дж., Ву Л., Ся Л. Ю., Шао Дж. и Ленг В. Д. (2018). «Потеря зубов связана с повышенным риском деменции и с зависимостью доза-реакция». Перед. Стареющие нейроски. 10:1–9. doi: 10.3389/fnagi.2018.00415

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кларк, Ф. М., и Фолкс, К. Г. (1997). «Доминирование и смена маток в содержащихся в неволе колониях эусоциального голого землекопа, гетероцефала глабера». Проц. Р. Соц. биол. науч. 264, 993–1000. doi: 10.1098/rspb.1997.0137

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кларк, Ф. М., и Фолкс, К. Г. (1998). Гормональные и поведенческие корреляты доминирования самцов и репродуктивного статуса в содержащихся в неволе колониях голого землекопа, Heterocephalus glaber . Биол. науч. 37, 1391–1399. doi: 10.1098/rspb.1998.0447

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Костанцо, М.С., Беннетт, Н.К., и Лютерманн, Х. (2009). «Пространственное обучение и память у африканских землекопов: роль социальности и пола». Физиол. Поведение 96, 128–134. doi: 10.1016/j.physbeh.2008.09.008

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Криш, С. Д., Денглер-Криш, К. М., и Катания, К. К. (2006). «Центральная зрительная система голого землекопа ( Heterocephalus glaber )’. Анат. Рек. Часть А Дис. Мол. Клетка. Эвол. биол. 288, 205–212. doi: 10.1002/ar.a.20288

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Криш, С. Д., Райс, Ф. Л. , Парк, Т. Дж., и Комер, К. М. (2003). «Соматосенсорная организация и поведение голых землекопов I: волоски на теле, похожие на вибриссы, составляют сенсорный массив, который опосредует ориентацию на тактильные раздражители». Поведение мозга. Эволу. 62, 141–151. дои: 10.1159/000072723

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Дикон, Р. (2012). «Оценка рытья нор, строительства гнезд и накопления мышей». Дж. Визу. Эксп. 59, 1–10. doi: 10.3791/2607

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

du Toit, L., Bennett, N.C., Nickless, A., and Whiting, M.J. (2012). «Влияние пространственной среды на обучение лабиринту у африканского землекопа». Знак животного. 15, 797–806. doi: 10.1007/s10071-012-0503-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Эдри Ю. Х., Парк Т. Дж., Канг Х., Бини А. и Баффенштейн Р. (2011). «Эндокринная функция и нейробиология самого долгоживущего грызуна, голого землекопа». Экспл. Геронт. Эльзевир 46, 116–123. doi: 10.1016/j.exger.2010.09.005

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Faulkes, CG, and Bennett, NC (2021). «Социальная эволюция африканских землекопов — сравнительный обзор». Доп. Эксп. Мед. биол. США 1319, 1–33. doi: 10.1007/978-3-030-65943-1_1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гилберт, Дж. Д., Росситер, С. Дж., и Фолкс, К. Г. (2020). «Отношения между индивидуальным фенотипом и разделением труда у голых землекопов: это сложно». PeerJ 8:e9891. doi: 10.7717/peerj.9891

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Граймс К.М., Барефилд Д.Ю., Кумар М., Макнамара Дж.В., Вайнтрауб С.Т., де Томбе П.П. и др. (2017). «Голый землекоп демонстрирует необычный профиль белка сердечной миофиламенты, что дает новое представление о сердечной функции этого естественно подземного грызуна». Арка Пфлюгера. Евро. Дж. Физиол. Арка Пфлюгера. Евро. Дж. Физиол. 469, 1603–1613. doi: 10.1007/s00424-017-2046-3

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хеффнер Р.С. и Хеффнер Х.Е. (1993). «Дегенеративный слух и локализация звука у голых землекопов ( Heterocephalus glaber ) с обзором центральных слуховых структур». J. Сравнительный анализ. Нейрол. 331, 418–433. doi: 10.1002/cne.₀₃₁₁

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Генри, Э. К., Ремпл, М. С., О’Риайн, М. Дж., и Катания, К. С. (2006). «Организация соматосенсорных областей коры голого землекопа ( Heterocephalus glaber )». J. Сравнительный анализ. Нейрол. 495, 434–452. doi: 10.1002/cne.20883

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Hetling, J. R., Baig-Silva, M. S., Comer, C. M., Pardue, M. T., Samaan, D. Y., Qtaishat, N. M., et al. (2005). ‘Особенности зрительной функции голого землекопа Heterocephalus glaber’ . J. Сравнительный анализ. Физиол. Нейроэтол. Сенатор Нейронное поведение. Физиол. 191, 317–330. doi: 10.1007/s00359-004-0584-6

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Джарвис, Дж. У. М., и Беннетт, Северная Каролина (2017). «Экология и поведение семейства Bathyergidae», в The Biology of the Naked Mole-Rat , eds PW Sherman, JUM Jarvis и RD Alexander (Princeton University Press), 66–96. дои: 10.1515/9781400887132-006

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Google Scholar

Кимчи Т. и Теркель Дж. (2001). «Пространственное обучение и память у слепыша в сравнении с лабораторной крысой и левантийской полевкой». Поведение животных. 61, 171–180. doi: 10.1006/anbe.2000.1565

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кимчи Т. и Теркель Дж. (2004). «Сравнение роли соматосенсорных стимулов в обучении лабиринту у слепого подземного грызуна и зрячего поверхностного грызуна». Поведение. Мозг Res. 153, 389–395. doi: 10.1016/j.bbr.2003.12.015

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ковальзон В. М., Аверина О. А., Высоких М. Ю. (2021). «Моторная активность и «неотенический» сон голого землекопа ( Heterocephalus glaber ) в условиях изоляции». Доклады биол. науч. 496, 25–29. doi: 10.1134/S0012496621010063

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ковальзон В. М., Аверина О. А., Миньков В. А., Петрин А. А., Ю М. (2020). Необычная корреляция между ритмами отдыха-активности и температурой тела у голого землекопа ( Heterocephalus glaber ) по сравнению с пятью другими видами млекопитающих. Дж. Эвол. Биохим. Физиол. 56, 451–458. doi: 10.1134/s00220050087

CrossRef Full Text | Google Scholar

Lin, C.S., Lin, H.H., Fann, S.W., Lee, W.J., Hsu, M.L., Wang, S.J., et al. (2020). «Связь между потерей зубов и объемом серого вещества при когнитивных нарушениях». Изображение мозга. Поведение 14, 396–407. doi: 10.1007/s11682-020-00267-w

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Маркей П.М., Медина Д.Х., Гачинска М., Осмульски П.А., Оддо С., Каккамо А. и др. (2015). «Бета-амилоид и самый долгоживущий грызун: голый землекоп как модель естественной защиты от болезни Альцгеймера». Нейробиол. Старение 6, 300–308. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2013.03.032.Amyloid

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мейсон, М. Дж., Корнуолл, Х. Л., и Смит, Э. С. Дж. (2016). Ушные структуры голого землекопа, Heterocephalus glaber и его родственники (rodentia: Bathyergidae)». PLoS One 11:e0167079. doi: 10.1371/journal.pone.0167079

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Моррис, Р. (1984). «Разработка процедуры водного лабиринта для изучения пространственного обучения у крыс». J. Neurosci. Методы 11, 47–60. doi: 10.1016/0165-0270(84)-4

CrossRef Full Text | Google Scholar

Нойманн К. и Кулик Л. (2020). «Иерархии доминирования животных по рейтингу Эло», версия пакета R 0.46.

Google Scholar

О’Риайн, М.Дж., и Джарвис, Дж.У.М. (1997). «Распознавание членов колонии и ксенофобия у голого землекопа». Поведение животных. 53, 487–498. doi: 10.1006/anbe.1996.0299

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Окамото Н., Морикава М., Окамото К., Хабу Н., Ивамото Дж., Томиока К. и др. (2010). «Связь потери зубов с легкими нарушениями памяти и когнитивными нарушениями: результаты исследования Фудживара-Кё». Поведение. Функция мозга. 6, 1–8. doi: 10.1186/1744-9081-6-77

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Оканоя К., Йосида С., Бароне К. М., Эпплгейт Д. Т., Бриттан-Пауэлл Э. Ф., Дулинг Р. Дж. и др. (2018). «Слухово-речевая связь у голого землекопа, млекопитающего с плохим слуховым порогом». J. Сравнительный анализ. Физиол. Нейроэтол. Сенатор Нейронное поведение. Физиол. 204, 905–914. doi: 10.1007/s00359-018-1287-8

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Оливериусова Л., Немец П., Кралова З. и Седлаек Ф. (2012). «Ориентация по магнитному компасу у двух строго подземных грызунов: приобретенное или видоспецифичное врожденное предпочтение направления?». Дж. Экспл. биол. 215, 3649–3654. doi: 10.1242/jeb.069625

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Олтон Д.С. и Самуэльсон Р.Дж. (1976). «Воспоминание о пройденных местах: пространственная память у крыс». Дж. Экспл. Психол. Поведение животных. проц. 2, 97–116. doi: 10.1037/0097-7403.2.2.97

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Oosthuizen, MK (2020). Исследовательское поведение, память и нейрогенез у социального дамараландского землекопа ( Fukomys damarensis ). Дж. Экспл. биол. 223:1093. doi: 10.1242/jeb.221093

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Oosthuizen, M. K., Scheibler, A.G., Bennett, N.C., and Amrein, I. (2013). «Влияние лабораторного жилья на исследовательское поведение, распознавание новизны и пространственную референтную память у подземного одиночного грызуна — слепыша (9).0023 Georychus capensis )’. PLoS One 8:1–8. doi: 10.1371/journal.pone.0075863

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

R Core Team (2021 г.). R: Язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд статистических вычислений R.

Google Scholar

Рюппель, Э. (1842). «Säugethiere aus der ordnung der nager, beobachtet im nordöstlichen Africa». Museum Senckenbergianum: Abhandlungen Aus Dem Gebiete der Beschreibenden Naturgeschichte 3, 99–101.

Google Scholar

Schleich, CE (2010). «Онтогенез пространственной рабочей памяти у подземного грызуна Ctenomys talarum» . Дев. Психобиол. 52, 592–597. doi: 10.1002/dev.20466

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Шерман П. В., Джарвис Дж.У.М. и Александр Р.Д. (1991). Биология голого землекопа. Принстон, Нью-Джерси: Издательство Принстонского университета.

Google Scholar

Смит, Э. С. Дж., Шумахер, Л.-Н., и Хассон, З. (2015). Голый землекоп как животная модель в медико-биологических исследованиях: современные перспективы. Открытый доступ к физиологии животных. 137:50376. doi: 10.2147/oaap.s50376

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Смит, М., и Баффенштейн, Р. (2021). «Управляемый уход за голыми землекопами BT», в The Extraordinary Biology of the Naked Mole-Rat , eds R. Buffenstein, TJ Park и MM Holmes (Cham: Springer International Publishing), 381–407. дои: 10.1007/978-3-030-65943-1_16

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тур И., Клемент Д., Карлсон Е. Н. и Холмс М. М. (2015). «Обоняние и социальное познание у эусоциальных голых землекопов. Heterocephalus Glaber’, Animal Behav. 107, 175–181. doi: 10.1016/j.anbehav.2015. 06.015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валлианатоу, К.А., Алонсо, А., Алеман, А., и Гензель, Л. (2020). Вызванные схемой сдвиги в навигационных стратегиях мышей раскрываются с помощью минимальной поведенческой модели пространственного исследования. bioRxiv [препринт]. doi: 10.1101/2020.12.21.423808

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Walcher, J., Ojeda-Alonso, J., Haseleu, J., Oosthuizen, M.K., Rowe, A.H., Bennett, N.C., et al. (2018). «Специализированные механорецепторные системы в гладкой коже грызунов». J. Physiol. 596, 4995–5016.

Google Scholar

Wilson, EO (1971). Общества насекомых. Кембридж, Массачусетс: Belknap Press of Harvard University Press.

Google Scholar

Яхав С. и Баффенштейн Р. (1992). «Функция слепой кишки обеспечивает энергию брожения без выделения тепла у пойкилотермных млекопитающих Heterocephalus glaber ». J. Сравнительный анализ. Физиол. 162, 216–218. doi: 10.1007/BF00357526

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Передовая морфология зубного аппарата слепыша [PeerJ]

Введение

Змеи — очень успешные хищники, колонизировавшие многочисленные места обитания (Ганс, 19 лет).61; Грин, 1983). Их успех отчасти объясняется особой морфологией, характерным для длинного тела, отсутствия функциональных конечностей, высокой подвижности черепа и характерных зубов (Greene, 1997; Cundall & Greene, 2000; Longrich, Bhullar & Gauthier, 2012). Морфология челюстей змей приспособлена для проглатывания добычи целиком, с черепным кинезисом и несросшимися зубными костями (нижнечелюстной симфиз), обеспечивающими широкое раскрытие (Cundall & Greene, 2000), и существует разнообразный диапазон форм и расположения зубов. помогать в поимке добычи (Грин, 19 лет)97; Нокс и Джексон, 2010 г.; Vaeth, Rossman & Shoop, 1985). Однако в последние годы разнообразие зубов змей мало исследовалось, особенно для неядовитых видов, несмотря на его важность для экологии змей и его интересную изменчивость среди таксонов.

Исследования морфологии зубов змей были в основном сосредоточены на традиционных системах доставки яда (например, Fry et al., 2012; Jackson, 2003; Vaeth, Rossman & Shoop, 1985). Змеиный клык обычно описывается как длинный заостренный верхнечелюстной зуб, приспособленный для переноса и распределения яда в ткани жертвы или нападающего (Jackson, 2003). Клыки могут быть трубчатыми, с бороздками или без канавок, при этом клыки без борозд отличаются от других увеличенных зубов наличием гребней вдоль дистальной ростральной и каудальной поверхности зуба и наличием ядовитой железы (Jackson & Fritts, 19).95; Джексон, 2007). Яд мог эволюционировать, чтобы помогать захватывать и защищать добычу (Fry et al., 2006; Casewell et al., 2013) и, возможно, играть роль в облегчении пищеварения (Savitzky, 1980; Thomas & Pough, 1979), но см. McCue ( 2007 г.) для альтернативного представления. Несмотря на отсутствие трубчатых или желобчатых структур в обычных зубах, зубной ряд неядовитых видов змей не обязательно простой. Зубные гребни довольно обычны как на зубных, так и на верхнечелюстных зубах ужеобразных, таких как Dipsadinae и Natricinae, а также водных Homalopsidae, все из которых имеют разнообразный рацион и среду обитания (Bogert, 19).64; Вэт, Россман и Шуп, 1985; Янг и Кардонг, 1996).

Модификация змеиных зубов, вероятно, способствовала эволюции и распространению змей (Jackson, 2003; De Oliveira et al., 2016; Savitzky, 1980) из-за новых возможностей кормления, связанных с формой и размером добычи, которые это предлагало (Gans, 1961). ; Грин, 1983). У ужеобразных диета (а не филогенетическая история), по-видимому, действует как сильнейшее селективное давление на эволюцию, в частности, специализированного верхнечелюстного зубного ряда (Knox & Jackson, 2010). Бритт, Кларк и Беннетт (2009 г.)) постулируют, что морфология зубов у подвязочных змей напрямую связана с диетическими предпочтениями и что у кормящихся особей, как правило, имеются зубные особенности, такие как гребни, которые отсутствуют у близкородственных кормящихся универсальных змей. Верхнечелюстные зубы североамериканской западной наземной подвязочной змеи, Thamnophis elegans, , и обыкновенной волчьей змеи из Юго-Восточной Азии, Lycodon aulicus capucinus, , имеют острые гребни или кили на задних краях (Jackson & Fritts, 2004; Райт, Кардонг и Бентли, 19 лет79). Это может быть адаптация к прорезанию чешуи сцинка, способствующая глубокому проникновению зубов в добычу и предотвращающая выход добычи изо рта во время поедания. Зубы североамериканской краснобрюхой змеи Storeria occipitomaculata также имеют дистальные кили, которые помогают удерживать скользкую добычу брюхоногого моллюска (Do Amaral, 1999). Таким образом, морфология зубов неядовитых змей тесно связана с типом добычи.

Кротовая змея ( Pseudaspis cana, Linnaeus 1758) является неядовитым лампрофиидом, который при обращении с ним способен причинять болезненные укусы, иногда требующие наложения швов, причем раны более серьезные, чем обычно при укусах неядовитых змей. Структура зубов, ответственных за эти укусы, ранее не описывалась, но предполагается, что они помогают в обращении с добычей в ограниченном пространстве, защите от землекопов или самцах в бою (Alexander & Marais, 2007; Broadley, 1983). Кротовые змеи включают в свой рацион кротов и роющих грызунов (Alexander & Marais, 2007), и вполне возможно, что сложность охоты в ограниченных норах могла стимулировать эволюцию развития этого поведения укусов и соответствующей морфологии зубов (Branch, 19).98). Было зарегистрировано, что молодые кротовые змеи охотятся на сцинков (Broadley, 1983), и, таким образом, еще одной возможной функцией острых зубов является помощь в прорезании чешуи сцинков (Branch, 1998). Западная килевидная змея, Pythonodipsas carinata , родственный таксон Pseudaspis , также имеет особую морфологию зубов — считается, что ее увеличенные небные клыки помогают извлекать добычу из нор (Branch et al., 1997). Точно так же диета и условия охоты могли способствовать развитию необычного укуса кротовой змеи.

Свидетельства характерного укуса кротовой змеи также были обнаружены у самцов конспецифика в результате борьбы самцов с самцами (G Alexander, личные наблюдения, 2015). Борьба между самцами описана у многих видов змей и обычно включает ритуальную борьбу (Shaw, 1951; Carpenter, 1977; Blouin-Demers, Gibbs & Weatherhead, 2005). Змеи-кроты необычны в том отношении, что бой между самцами включает в себя укусы, которые могут привести к травмам (Greene, 1997; Branch, 1998), и раны, наносимые самцами кротових змей соперникам в виде парных параллельных порезов поперек и вокруг тела (G Александр и А. Эванс, личные наблюдения, 2015 г., рис. 1A и 1B).

Рисунок 1: Фотографии свежих ран (A) и шрамов от прошлых ран (B) на самцах слепышовых змей, полученных во время боя между самцами.

Фото: Грэм Александр (A), Николас Эванс (B).

Мы изучили внешнюю структуру зубов кротовой змеи с помощью микро-КТ (компьютерной томографии) и СЭМ (сканирующей электронной микроскопии), чтобы исследовать зубы, ответственные за нанесение характерных параллельных надрезов. Мы также исследовали, присутствует ли половой диморфизм в размере, изменчивости и форме зубов в зубных рядах кротовых змей и в частоте укушенных ран на музейных экземплярах. Если кротовые змеи имеют неоднородные зубные ряды вдоль зубного ряда и демонстрируют значительные различия в форме и размере зубов между полами, то вполне вероятно, что самцы используют эти зубы для стратегии успеха в бою, особенно если параллельные следы укусов присутствуют только у самцов. . Черты, которые проявляются как у самцов, так и у самок, вероятно, больше указывают на специализацию добычи или другую адаптацию, не связанную с боем.

Материалы и методы

Головы 14 особей Pseudaspis cana (Linnaeus 1758) (7 ♂; 7 ♀), собранных в провинции Гаутенг, Южная Африка, были отсканированы с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) в Центре микрофокусной рентгеновской КТ в Институт эволюционных наук Университета Витватерсранда, Йоханнесбург (использование образцов было одобрено Комитетом по этике исследований на животных Университета Витватерсранда, отказ № 2004/28/1). Пол каждой особи определяли с помощью зондирования клоаки. Восемь экземпляров были найдены свежеубитыми (убитыми на дороге), а остальные образцы (консервированные в этаноле или формалине) были взяты на время из Музея естественной истории Дитсонг, Гаутенг, Южная Африка. Образцы большего размера (длина головки >40 мм) сканировались при 70 кВ, 120 мкА, 1 кадр/с, 1 fa и 2000 проекций, а образцы меньшего размера (длина головы <40 мм) — при 120 кВ, 150 мкА, 1 кадр/с. , 1 фа и 2000 проекций. КТ черепа и зубного аппарата каждого образца были реконструированы с помощью CT Pro 3D, а затем сегментированы в цифровом виде и проанализированы с использованием программного обеспечения для визуализации КТ VG Studio Max 3.0 (Volume Graphics, 2014). Это программное обеспечение позволило создать точные 3D-модели с высоким разрешением зубного аппарата змеи и его соединения с черепным скелетом.

Зубы Dendentary были исследованы путем подсчета количества зубов с острыми краями и сравнения между отдельными особями и полами. Заметные различия в размерах зубов верхней челюсти в разных положениях вдоль челюсти (в отличие от довольно одинакового размера зубов нижней челюсти) побудили нас измерить и сравнить объемы зубов верхней челюсти. Зубы верхней челюсти анализировали путем сравнения положения, формы и размера зубов в различных положениях на верхней челюсти у каждого человека. Объемы были извлечены в VG Studio Max 3.0 после цифровой сегментации отдельных зубов и челюстей черепа. Длина зубьев измерялась с помощью Avizo 9.но не использовались в анализе, потому что различия в степени кривизны зубов (которые не измерялись из-за высоких различий внутри и между отдельными людьми) означали, что длины не давали надежного измерения размера зубов.

Были проведены измерения зубов верхней челюсти для двух самых передних зубов (T1 и T2), двух зубов посередине верхней челюсти (T6 и T7) и трех самых задних зубов (T11–T13) как левой, так и правой верхней челюсти, чтобы исследовать вариация зубов вдоль верхней челюсти (рис. 2). Значения для недоразвитых зубов (еще не прикрепленных к зубочелюстному элементу) были исключены из анализа. Объем зуба измеряли как общий объем зуба с цифровым сегментированием. Объемы нижней правой и левой челюстей (составной и зубной костей вместе) были измерены и использованы в качестве косвенного показателя размера черепа и средства оценки эффектов аллометрии из-за довольно жесткой структуры нижней челюсти. Соединение между зубной и сложной костями заполнено коллагеновой тканью, которая может допускать небольшое количество движений, но это очень ограничено по сравнению с движением и, следовательно, аддитивной ошибкой, которая была бы связана с измерением всего черепа с несколькими кинетические части.

Рисунок 2: Микро-КТ (компьютерная томография) реконструкция левой верхней челюсти слепыша, показывающая зубы верхней челюсти, выбранные для статистического анализа.

Частота укусов кротовых змей была исследована на 50 образцах из Музея естественной истории Дитсонг. Каждую змею осматривали на наличие открытых ран или шрамов и отмечали пол. Мы записали все порезы на теле и отметили серьезность. Хотя не всегда возможно окончательно отличить раны, полученные в результате единоборства, от ранений, полученных по другим причинам, предполагается, что поперечные порезы более 25% ширины тела, в частности спиральные порезы, вероятно, были нанесены в бою между самцами. , в то время как чешуя или очень короткие шрамы (<25% ширины спинной поверхности) не считались результатом укусов сородичей. Положение разрезов регистрировали либо в области хвоста (от клоаки до кончика хвоста), либо в области туловища каждого экземпляра.

Деталь зуба была качественно исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Зубы, представляющие интерес (при исследовании 3D-моделей КТ), были покрыты 10-нм углеродом и 5-нм сплавом золото-палладий (60:40), а затем были микрофотографированы с использованием FEI Quanta 200 E-SEM в Отделе микроскопии и микроанализа в в школе наук о животных, растениях и окружающей среде Университета Витватерсранда в Йоханнесбурге.

Анализ данных

Все статистические анализы проводились с использованием RStudio версии 3.2.5 (R Core Team, 2014 г.). Измерения объема зубов использовались в серии сравнений, зуб за зубом, внутри отдельных людей, между людьми и между полами. Чтобы учесть различия в размерах отдельных змей, объемы зубов каждой особи сначала делили на объем нижней челюсти соответствующей особи. Среднее значение левого и правого зубов для каждого из измеряемых зубов рассчитывали для каждого образца (например, объемы Т1 на левой верхней челюсти и Т1 на правой верхней челюсти, чтобы получить средний объем Т1 для образца). То же самое было сделано для измерений нижней левой и правой челюсти, чтобы получить средний объем нижней челюсти.

После проверки на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка односторонний ANOVA был использован для измерения внутрииндивидуальной вариации логарифмически преобразованных объемов зубов в различных положениях на верхней челюсти. Половые различия были проверены с использованием многофакторного дисперсионного анализа с учетом пола в качестве фактора. Тесты проводились с семью средними объемами зубов верхней челюсти в положениях, описанных выше (T1, T2, T6, T7, T11, T12 и T13; см. рис. 2). Критерии суммы рангов Уилкоксона использовались для проверки того, различаются ли объемы нижних челюстей, количество зубных зубов и средний объем зубов верхней челюсти у самцов и самок слепышовых змей. Тест хи-квадрат проверял, существует ли связь между частотой ран от укусов сородичей и полом.

Результаты

Морфология верхнечелюстных и нижнечелюстных зубов слепыша

Каждая верхняя и зубная кости имели непрерывный ряд твердых акродонтных зубов (прикрепленных непосредственно к кости челюсти), которые различались по размеру и форме (рис. 2 и 3). Сменные зубы (удаленные с КТ-изображений) лежат с медиальной стороны функциональных зубов.

Рисунок 3: Микро-КТ (компьютерная томография) реконструкция левого бокового вида черепа самца кротовой змеи, показывающая череп (cr), квадратную (q), составную (co), зубную (d) и верхнюю челюсть (m) кости.

Зубной ряд

Каждая из отдельных зубных костей имела от 14 до 16 зубов. Эти зубы были загнуты назад, а некоторые имели задние кили (острые гребни/края) (рис. 3 и 4), в то время как зубы без острых краев были просто коническими, сужающимися к острию. Количество зубов с острыми килями варьировало у разных змей, от 5 до 13 на каждой зубной кости, и отсутствовало у некоторых экземпляров (см. Половые различия относительной формы и объема зубов 9).0024 ниже). Когда они присутствовали, кили встречались в самых задних зубах.

Рисунок 4: СЭМ (сканирующая электронная микроскопия) изображение заднего нижнечелюстного зуба самца слепыша, на заднем крае которого виден лезвиеобразный киль.

Зубы верхней челюсти

Зубы верхней челюсти различались по размеру и форме вдоль каждой кости верхней челюсти с заметными различиями между передними и задними зубами (рис. 2). Количество зубов верхней челюсти было в основном одинаковым (13 зубов с каждой стороны) у всех образцов, при этом у одного образца в этом исследовании было 14 зубов на одной верхней челюсти. Зубы на переднем конце и в середине верхней челюсти были длинными, коническими, загнутыми в основании зубов (рис. 2). Два самых задних зуба (T12 и T13) имели характерную форму: они были лабио-лингвально уплощенными и треугольными, а не коническими, а в некоторых образцах были направлены почти прямо кзади от основания зуба, а не перпендикулярно и слегка загибались назад к опорному зубу. maxilla, как и в случае более передних зубов (рис. 2 и 5). Т12 и Т13 также имели острые задние/дорсальные края у всех экземпляров (рис. 5).

Рисунок 5: СЭМ (сканирующая электронная микроскопия) изображения задних зубов верхней челюсти (T12, T13) самца слепыша (A), подчеркивающие лезвиеобразный киль вдоль заднего края T13 (B).

ANOVA-тест объемов T1, T2, T6, T7, T11, T12 и T13 для всей выборки слепышей показал, что зубы, расположенные вдоль верхней челюсти, значительно различаются по объему по сравнению друг с другом ( F _(1,6)  = 12,37, р <0,001; Таблица 1). Апостериорный тест Тьюки показал, что зубы на заднем конце верхней челюсти (T12 и T13) были значительно больше, чем зубы T1, T2, T6, T7 и T11 (таблица 1). Средний объем Т13 более чем в два раза превышал объем Т1, Т2, Т6, Т7 и Т11 ( p <0,01 для всех сравнений), а Т12 был как минимум на 40% больше, чем Т1 ( p <0,001), Т2 ( p <0,01) и T11( p <0,001) (рис. 6; табл. 1).

907:50 Таблица 1:

Значимые результаты тестов ANOVA и post hoc , сравнивающих объемы зубов в различных положениях на верхней челюсти для всей выборки (14) и для отдельных полов (7m, 7f) слепышей.

Результат проверки гипотезы	Попарное сравнение зубов	Весь образец	Кобели	Самки
Дисперсионный анализ p -значение		<0,000001	0,000029	0,000089
ANOVA F статистика		12. 370000	7.153000	6.2
Tukey post hoc p -значение	Т12-Т1	0,000093		0,001468
	Т13-Т1	<0,000001	0,000568	0,001129
	Т12-Т11	0,000015	0,009328	0,005811
	Т13-Т11	0,000001	0,000023	0,004531
	Т2-Т12	0,009367		0,028693
	Т2-Т13	0,000042	0,006182	0,022934
	Т6-Т13	0,000447	0,002442
	Т7-Т13	0,001529	0,017644

DOI: 10. 7717/peerj.6943/таблица-1

Рисунок 6: Средние объемы (мм

³ ) и стандартные ошибки передних (T1 и T2), средних (T6 и T7) и задних (T11–T13) зубов верхней челюсти семи самцов слепыша (M) и семи самок слепыша. (Ф).

Половые различия формы и объема зубов

Наиболее выраженные половые различия в зубном ряду были в зубных рядах. Все самцы имели задние кили (острые края) от 5 до 13 зубов на каждой зубной кости. У самок отсутствовали острые задние края на нижнечелюстных зубах, их зубы имели закругленные края по сравнению с отчетливо острыми зубами у самцов. У каждого экземпляра было от 14 до 16 зубов на каждой зубной кости, но вариации числа зубов не зависели от пола (критерий суммы рангов Уилкоксона, 9).0023 Вт  = 27,5, p >0,9).

В среднем зубы, расположенные вдоль кости верхней челюсти, значительно различались по объему по сравнению друг с другом как для мужчин, так и для женщин (однофакторный дисперсионный анализ для каждого пола, мужчины: F _(1,6)  = 7,153, p <0,001; самки: Ж _(1,6)  = 6,292, p <0,001; табл. 1). Апостериорный тест Тьюки показал, что у мужчин среднее значение T13 было больше, чем T1 ( p <0,001), T2 ( p <0,01), T6 ( p <0,01), T7 ( p = 0,02) и T11 ( p <0,001), а T12 больше, чем T11 ( p <0,01) (табл. 1). У самок Т13 был больше, чем Т1 ( p <0,01), Т2 ( p = 0,02) и Т11 ( p <0,01), а Т12 был аналогично больше, чем Т1 ( p <0,01), Т2 ( p = 0,03) и T11 ( p <0,01) (рис. 6; табл. 1).

Четкие формы и большие размеры Т12 и Т13 по сравнению с другими зубами у самцов проявлялись более ярко, чем у самок (рис. 6 и 7). Критерий суммы рангов Уилкоксона не смог выявить значимой разницы между полами для среднего объема T12 ( W = 24, p > 0,9) и T13 ( W = 36, p = 0,165). Однако многофакторный дисперсионный анализ с числом зубов, полом и взаимодействием пола и зуба в качестве факторов выявил влияние пола на объем зубов (9).0023 F _(1,1)  = 5,512, p  = 0,0213), что указывает на то, что пол способствовал различиям в средних объемах зубов между людьми (видно на рис. 6). Не было никакой разницы между средними объемами нижней челюсти мужчин и женщин (мужчины 46,9 ± 6,3 мм ³ , женщины 44,5 ± 5,1 мм ³ ; W = 23, p = 0,90), что указывает на то, что различия в относительные размеры зубов верхней челюсти не были артефактами различий в объемах челюстей.

Рисунок 7: Реконструкции микро-КТ (компьютерной томографии), сравнивающие боковую проекцию левой верхней челюсти, зубной кости и сложных костей самки (A) с таковой самца (B) слепыша.

Шрамы на музейных экземплярах

Доля самцов со шрамами или ранами была значительно выше, чем доля самок со шрамами или ранами ( х ²  = 5,5987, d , f . = 1, p ,1 8 = ). Из 50 изученных музейных экземпляров (28 взрослых самцов, 14 взрослых самок и 8 ювенильных) 9у взрослых самцов и у 1 взрослой самки были обнаружены следы рубцов или ран различной длины и глубины по оси тела. Шесть из этих самцов имели шрамы в области хвоста, начиная от рубца, огибающего хвост дважды по спирали у двух экземпляров (например, на рис. 1А), до пореза или рубца на вентральной поверхности хвоста у трех экземпляров и до небольшого , неглубокий рубец только на части дорсальной поверхности у одного экземпляра. У этого экземпляра также были параллельные надрезы, проникающие через брюшную чешую в мышцу ближе к середине туловища. Рубцы остальных трех самцов были обнаружены ближе к середине змеи и также различались по степени тяжести: от одного длинного рубца на брюшной поверхности тела до множества мелких рубцов, не покрывающих ширину змеи как на спинной, так и на брюшной поверхностях. тела. У единственной самки был неглубокий рубец над хвостом, который в этом месте составлял половину ширины спинной поверхности.

Обсуждение

Способность кротовой змеи наносить режущие укусы была отмечена рядом полевых проводников и неосторожных дрессировщиков, но до этого исследования не сообщалось о том, какие зубы вызывают это, и различаются ли эти зубы у разных полов. Явный признак полового диморфизма очевиден в зубных зубах кротовой змеи, некоторые из которых имеют заметно острые задние края (кили) только у самцов. У обоих полов два самых задних зуба на верхней челюсти заметно крупнее, лабио-лингвально уплощены, а их апикобазальная ось сильно ориентирована назад, тогда как у более передних зубов верхней челюсти она ориентирована дорсовентрально. Хотя эти верхнечелюстные зубные признаки присутствуют у обоих полов, что указывает на возможную неспецифическую для пола функцию, задние верхнечелюстные зубы более выражены у мужчин. Половой диморфизм зубов, а также более высокая частота рваных ран у самцов указывают на то, что у самцов слепышовых змей есть специальные зубные ряды, которые помогают в бою.

Вполне вероятно, что острые нижние зубы, а также задние верхнечелюстные зубы играют важную роль в создании режущих ран, типичных для укуса слепыша. Когда пасть полностью открыта, задние верхнечелюстные зубы (T12 и T13) направлены вниз и, вероятно, будут первыми зубами, вступающими в контакт с целью, как у некоторых других змей (Wright, Kardong & Bentley, 1979). Поведенческие исследования необходимы, чтобы установить точное движение челюстей и зубов во время укуса, но мы предполагаем, что есть два способа, которыми кротовая змея может укусить, чтобы вызвать эти раны: задние верхнечелюстные зубы закрепляют цель, в то время как нижняя челюсть, благодаря двойному сочленению квадратной кости он отклоняется назад, позволяя нижнечелюстным зубам прорезать добычу, гипотеза, которая согласуется с наличием более серьезных ран на вентральных поверхностях музейных образцов или задних верхнечелюстных зубах. вызывают раны, когда верхняя челюсть впервые соприкасается с соперничающей змеей во время укуса.

Рваные раны, подобные тем, которые вызваны укусами слепышовых змей, не были задокументированы у многих неядовитых видов змей, и единственными сопоставимыми видами являются австралийский ковровый питон ( Morelia spilota ) и змея кукри ( Oligodon formosanus ), оба вида которые участвовали в агрессивных боях сородичей (Shine & Fitzgerald, 1995; Huang et al. , 2011). Как и кротовая змея, ковровый питон наносит серьезные, похожие на раны укусы соперничающих самцов, соревнуясь за самку, но область тела, на которую направлены укусы, не задокументирована. Увеличенные верхнечелюстные зубы змеи кукри служат для нанесения режущих ран соперникам (неспецифическим по полу) при защите кормовой территории, а также помогают вскрывать черепашьи яйца (Huang et al., 2011). Самцы змей кукри чаще кусают хвост, чем самки, но укусы самцов змей кукри, как правило, менее серьезны, чем у самок. Хуанг и др. (2011) предполагают, что это развилось в ответ на риск повреждения репродуктивных органов.

В отличие от змеи кукри, у самцов кротовых змей больше шансов повредить хвост (и, в некоторой степени, туловище), чем у самок. Наличие задних килей на зубных зубах самцов слепыша и отсутствие этого признака у самок, а также более заметно увеличенные задние верхнечелюстные зубы самца слепыша позволяют предположить, что эти признаки могут давать некоторое преимущество, например, во время драки самцов наблюдаются в период размножения (Alexander & Marais, 2007; Broadley, 19 лет). 83). С точки зрения адаптации преимущество наличия зубов, которые наносят длинные или спиральные порезы в бою, а не более распространенные колотые раны, может заключаться в том, что они наносят больший ущерб хвосту конкурирующего самца, где расположены гемипены, уменьшая шансы соперника на поражение. репродуктивный успех, чтобы увеличить количество самок, доступных для победителя. Заметим, однако, что мы не можем сделать вывод о том, что самки не наносят укусов самцам, а также что хвост может быть просто наиболее доступной частью анатомии самца во время боя (Huang et al., 2011). Шанс повредить репродуктивные органы соперника, даже если он не нацелен конкретно на этот регион, мог привести к тому, что это поведение стало избранным в популяции.

Наличие специализированных верхнечелюстных зубов у обоих полов слепыша предполагает, что эти зубы либо обеспечивают одинаковые преимущества для каждого пола, либо являются результатом вынужденной эволюции у самок ( sensu Gould & Lewontin, 1979; Gould, 1993). Специализированные зубы верхней челюсти довольно часто встречаются у колуброидов (Vaeth, Rossman & Shoop, 1985; Scanlon & Shine, 1988; Jackson & Fritts, 1995) и, как правило, коррелируют со специализацией в питании (Knox & Jackson, 2010). Наиболее вероятное адаптационистское объяснение наличия острых треугольных задних зубов верхней челюсти у обоих полов слепыша состоит в том, что эти зубы связаны с особыми потребностями в питании. Увеличенные задние верхнечелюстные зубы (а у некоторых видов и крыловидные зубы) обычно связаны с поеданием скользкой добычи, такой как рыба (Wright, Kardong & Bentley, 19).79) или оофагии (Scanlon & Shine, 1988). Несмотря на то, что рацион кротовых змей недостаточно задокументирован (взрослые особи питаются в основном мелкими роющими млекопитающими, а молодые особи преимущественно ящерицами, Alexander & Marais, 2007; состоит ли она из особо скользкой добычи. Тем не менее, Бродли (1983) и Дайер (1996) сообщают о том, что слепыши поедают целые птичьи яйца, которые могут быть важным компонентом рациона в некоторых популяциях. Таким образом, гипотеза адаптационистской диеты может быть частичным объяснением специализированных зубов верхней челюсти у кротовых змей.

Родственный таксон кротовой змеи, западная килевидная змея ( Pythonodipsas carinata ), имеет увеличенные небные «клыки», которые могут помочь в извлечении добычи из нор (Branch et al., 1997) или для удерживания гекконов (Marx et al., 1997). др., 1982). Точно так же среда обитания для охоты, а не анатомия добычи, возможно, способствовала выбору специализированных зубов у кротовой змеи, если зубы помогали добывать добычу в ограниченных роющих пространствах, в которых кротовые змеи иногда охотятся. Однако в литературе это мало подтверждается, и, в отличие от слепыша, неядовитые роющие змеи, как правило, имеют маленькие, неизменные зубы (Савицки, 19).83).

Альтернативное объяснение специализации зубов верхней челюсти у кротовых змей состоит в том, что задние зубы являются филогенетическими остатками клыков предков. Джексон (2007) утверждает, что исходным состоянием Colubroidea было наличие трубчатых клыков на верхней челюсти, и что неядовитые виды в этой кладе, следовательно, должны были впоследствии утратить клыки и способность производить яд. Кроме того, она отличает клыки без бороздок от увеличенных зубов по наличию килей вдоль ростральной и каудальной поверхностей зуба — признаков, которые присутствуют в увеличенных верхнечелюстных зубах у кротов. Согласно Кардонгу (1982), мы не определяем зубы слепыша как клыки из-за отсутствия ядовитых желез и исключительно мукоидной функции желез Дювернуа (Taub, 1967). Однако наличие этих зубов у кротовых змей может указывать на происхождение клыков предков без канавок, которые были использованы в качестве точки привязки, позволяя нижней челюсти разрезать тела соперников-самцов, сохраняя при этом чужие (посредством отсутствие отбора для потери зубов), или для выгоды при отправке добычи или поедании яиц у самок.

Выводы

Наши наблюдения проливают свет на малоизученную кротовую змею и могут послужить основой для будущих функциональных исследований змеиных зубов, захвата добычи и полового диморфизма. Дальнейшее исследование могло бы выяснить, склонны ли самцы кротовых змей кусать хвосты соперников больше, чем остальную часть тела, и как повреждение хвоста влияет на репродуктивный успех кротовых змей. Изучение охотничьего поведения и кинетики черепа может установить точный механизм укуса слепыша, а функциональное сравнение с другими видами будет способствовать более полной картине характерного зубного аппарата слепыша.

Благодарности

Особая благодарность Кудакваше Джакате и Жаку Герберу за обучение и руководство в области компьютерной томографии и электронной электронной микроскопии. Большое спасибо Лауретте Махлангу из Музея естественной истории Дитсонга, Филипу Джордану, Адриану Стейну и Клинту Халкетт-Сиддаллу за предоставленные образцы, а также Майку Перри за то, что он позволил нам сфотографировать его живых кротовых змей.

Ссылки

• Александр Г., Марэ Ж. 2007 . Путеводитель по рептилиям юга Африки. Кейптаун: Струик.

• Блуэн-Демерс Г., Гиббс Х.Л., Уэзерхед П.Дж. 2005 . Генетические доказательства полового отбора у черных крысиных змей, Elaphe obsoleta . Поведение животных 69 :225-234

• Богерт СМ. 1964 . Змеи родов Diaphorolepis и Synophis и ужеобразные подсемейства Xenoderminae. Senckenbergiana Biologica 45 :509-531

• Отделение WR. 1998 . Полевой определитель змей и других рептилий юга Африки. Кейптаун: Струик.

• Бранч В., Шайн Р., Харлоу П., Уэбб Дж. 1997 . Половой диморфизм, рацион и аспекты размножения западной килевидной змеи, Pythonodipsas carinata (Serpentes: Colubridae) African Journal of Herpetology 46 :89-97

• Бритт Э. , Кларк А., Беннетт А. 2009 . Морфология зубов подвязочных змей ( Thamnophis ) и их связь с диетическими предпочтениями. Журнал герпетологии 43 :252-259

• Бродли Д.Г. 1983 . Змеи Фиц-Саймонса из Южной Африки. Йоханнесбург: Книги Дельты.

• Плотник CC. 1977 . Общение и проявления змей. Американский зоолог 17 :217-223

• Кейсвелл Н.Р., Вюстер В., Вонк Ф.Дж., Харрисон Р.А., Фрай Б.Г. 2013 . Сложные коктейли: эволюционная новизна ядов. Тенденции в области экологии и эволюции 28 :219-229

• Кандалл Д., Грин Х.В. 2000 . Кормление змей. В кн.: Питание: форма, функции и эволюция четвероногих позвоночных. Сан-Диего: Академическая пресса. 293-333

• Де Оливейра Л., Скартоццони Р.Р., Де Алмейда-Сантос С.М., Джаред С., Антониацци М.М., Да Саломао Г.М. 2016 . Морфология желез Дювернуа и зубов верхней челюсти и возможная функция секреции желез Дювернуа у Helicops Modetus Günther, 1861 (Serpentes: Xenodontinae) South American Journal of Herpetology 11 :54-65

• У Амарала JPS. 1999 . Скручивание губ у краснобрюхих змей ( Storeria occipitomaculata ): функциональная морфология и экологическое значение. Журнал зоологии 248 :289-293

• Красильщик БМ. 1996 . Нападение змей на морских птиц на трех южноафриканских островах. South African Journal of Marine Science 17 :309-313

• Фрай Б.Г., Кейсуэлл Н.Р., Вюстер В., Видал Н., Янг Б., Джексон Т.Н. 2012 . Структурная и функциональная диверсификация ядовитой системы рептилий Toxicofera. Токсикон 60 :434-448

• Фрай Б.Г., Видал Н., Норман Дж.А., Вонк Ф.Дж., Шейб Х., Рамджан С.Р., Куруппу С., Фунг К., Хеджес С.Б., Ричардсон М.К. 2006 . Ранняя эволюция ядовитой системы ящериц и змей. Природа 439 :584-588

• Ганс К. 1961 . Механизм питания змей и его возможная эволюция. Американский зоолог 1 :217-227

• Гулд С.Дж. 1993 . Мужские соски и рябь клитора. Колумбия: журнал литературы и искусства 20 :80-96

• Гулд С.Дж., Левонтин Р.К. 1979 . Петли Сан-Марко и панглоссианская парадигма: критика адаптационистской программы. Труды Лондонского королевского общества. Серия B: Биологические науки 205 :581-598

• Грин ХВ. 1983 . Диетические корреляты происхождения и излучения змей. Американский зоолог 23 :431-441

• Грин ХВ. 1997 . Змеи: эволюция тайны в природе. Беркли: Калифорнийский университет Press.

• Хуанг В.С., Грин Х.В., Чанг Т.Дж., Шайн Р. 2011 . Территориальное поведение тайваньских кукризнейков ( Oligodon formosanus ) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 :7455-7459

• Джексон К. 2003 . Эволюция систем доставки яда у змей. Зоологический журнал Линнеевского общества 137 :337-354

• Джексон К. 2007 . Эволюция ядовитых клыков: выводы из биологии развития. Токсикон 49 :975-981

• Джексон К., Фриттс Т.Х. 1995 . Доказательства морфологии поверхности зуба для заднего верхнечелюстного происхождения клыка протероглифа. Амфибии-Рептилии 16 :273-288

• Джексон К., Фриттс Т.Х. 2004 . Специализация зубов при дурофагии у обыкновенной волчьей змеи, Lycodon aulicus capucinus . Амфибия-Рептилия 25 :247-254

• Кардонг К. В. 1982 . Эволюция ядовитого аппарата змей от ужеобразных до гадюк и элапидов. Memrias do Instituto Butantan 46 :105-118

• Нокс А., Джексон К. 2010 . Экологические и филогенетические влияния на зубной ряд верхней челюсти у змей. Phyllomedusa: журнал герпетологии 9 :121-131

• Longrich NR, Bhullar B-AS, Gauthier JA. 2012 . Переходная змея из позднемелового периода Северной Америки. Природа 488 :205-208

• Маркс Х., Рабб Г.Б., Арнольд С.Дж., Арнольд С.Дж. 1982 . Pythonodipsas и Spalerosophis , роды ужеобразных змей, сходные с гадюками. Копейя 3 :553-561

• МакКью, Мэриленд. 2007 . Отравление жертвы не улучшает пищеварительную функцию западных гремучих змей (Crotalus atrox)

• R Основная команда. 2014 . R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд статистических вычислений R. программное обеспечение

• Савицкий А.Х. 1980 . Роль стратегии доставки яда в эволюции змей. Эволюция 34 :1194-1204

• Савицкий А.Х. 1983 . Коадаптированные комплексы признаков у змей: окаменелость, рыбоядность и дурофагия. Американский зоолог 23 :397-409

• Скэнлон Дж.Д., Шайн Р. 1988 . Зубной ряд и диета у змей: приспособление к оофагии у австралийского рода элапидов Симоселэпс . Журнал зоологии 216 :519-528

• Shaw CE. 1951 . Бой самцов американских ужеобразных змей с примечаниями к боевым действиям других ужеобразных и неуклюжих змей. Herpetologica 7 :149-168

• Шайн Р., Фицджеральд М. 1995 . Различия в системах спаривания и половой диморфизм между популяциями австралийского питона Morelia spilota (Serpentes: Pythonidae) Oecologia 103 :490-498

• Тауб А.М. 1967 . Сравнительные гистологические исследования железы Дювернуа ужеобразных змей. Бюллетень AMNH 138 :статья 1

• Томас Р., Паф Ф.Х. 1979 . Влияние яда гремучей змеи на переваривание добычи. Токсикон 17 :221-228

• Vaeth RH, Rossman DA, Shoop W. 1985 . Наблюдения за морфологией поверхности зубов змей. Журнал герпетологии 19 :20-26

• Объемная графика. 2014 . VGStudio Макс. программное обеспечение

• Райт Д.Л., Кардонг К.В., Бентли Д.Л. 1979 . Функциональная анатомия зубов западной наземной подвязочной змеи, Thamnophis elegans . Герпетология 35 :223-228

• Янг Б.А., Кардонг К.В. 1996 . Элементы поверхности зубов у змей (Reptilia: Serpentes) Amphibia-Reptilia 17 :261-276

Мотокультиватор Крот

Содержимое

• 1 Обзор популярных моделей
  • 1. 1 Мотокультиватор МК-1А
  • 1.2 Мотокультиватор Крот 2 с реверсом
• 2 Руководство по эксплуатации мотокультиватора Крот
• 3 Модернизация модели МК-1А

Производство отечественных мотокультиваторов марки «Крот» было налажено в конце 80-х годов. Первая модель МК-1А оснащалась двухтактным бензиновым двигателем объемом 2,6 л. из. Запуск осуществлялся от тросового ручного стартера. Изначально техника предназначалась для обработки небольших огородов на даче и работы внутри теплицы. Современный мотокультиватор Крот представляет усовершенствованную модель МК-1А. Эта техника уже оснащена мощным двигателем с принудительным воздушным охлаждением.

Обзор популярных моделей

Примерные размеры оборудования находятся в пределах:

• длина — от 100 до 130 см;
• ширина — от 35 до 81 см;
• рост — от 71 до 106 см.

Габариты культиватора Крот зависят от модели, и могут меняться по мере совершенствования техники.

Мотокультиватор МК-1А

Начнем обзор культиваторов «Крот» с модели МК-1А. Агрегат оснащен двухтактным карбюраторным двигателем мощностью 2,6 л.с. В качестве пускового устройства используется тросовая рукоятка. Бензиновый двигатель с коробкой передач имеет простое болтовое соединение с рамой. Топливный бак рассчитан на 1,8 литра. Такой небольшой объем обусловлен малым расходом топлива. Агрегат можно заправлять дешевым бензином АИ-80 или А-76. Для приготовления топливной смеси используется машинное масло марки М-12ТП. Культиватор весит всего 48 кг. Такое оборудование легко перевезти на дачу на автомобиле.

На рукоятках расположены все элементы управления мотокультиватора, а именно:

• рычаг сцепления;
• рычаг управления дроссельной заслонкой;
• Рычаг управления заслонкой карбюратора.

Модель «Крот МК-1А» способна работать с навесным оборудованием. Мотокультиватор используется для полива, скашивания травы, обработки почвы и ухода за насаждениями.

Мотокультиватор Крот 2 с реверсом

Особенностью конструкции является то, что культиватор «Крот» имеет реверс и мощный двигатель. Это дает возможность потребителю за небольшие деньги получить настоящий мотоблок. Агрегат приводится в движение четырехтактным бензиновым двигателем Honda GX200 объемом 6,5 л. из. Крот 2 имеет электронное зажигание, вал отбора мощности, бензобак на 3,6 литра. Крутящий момент от двигателя к шасси передается ременной передачей.

Среди других мотоциклов с аналогичными характеристиками эта модель Крота занимает первые позиции по надежности. Эти показатели были достигнуты благодаря мощному одноцилиндровому мотору и надежной коробке передач. Ресурс двигателя 3500 часов. Это довольно много по сравнению со старыми моделями культиватора «Крот», имевшими моторесурс до 400 часов.

Важный! Большой плюс четырехтактного двигателя в том, что масло и бензин хранятся отдельно. Владельцу больше не нужно вручную готовить топливную смесь, смешивая эти компоненты.

Мощности мотокультиватора с задним ходом хватает, чтобы фрезы захватили участок шириной 1 м. В инструкции по эксплуатации от завода производителя сказано, что мотокультиватор Крот 2 способен расширить свой функционал за счет использования навесного оборудования. Так, техника может стать снегоуборщиком или косилкой, транспортным средством для перевозки грузов, машиной для выполнения многих сельскохозяйственных работ.

Важный! Рукоятки мотокультиватора Крот 2 имеют многоступенчатую регулировку. Оператор может поворачивать их в любую сторону, что позволяет оптимально настроить оборудование под любой вид работ.

В видео предлагаем посмотреть обзор культиватора Крот:

Руководство по эксплуатации мотокультиватора Крот

Итак, мы выяснили, что современный культиватор «Крот» имеет практически все функции мотоблока. А теперь посмотрим, что написано в инструкции по эксплуатации рассматриваемой техники:

• Прямое назначение культиватора – вспашка земли. Делается это с помощью фрез, которые устанавливаются на валы редуктора. Транспортные колеса поднимаются во время вспашки. Сошник прикреплен к задней части прицепной скобы. Используется в качестве тормоза, а также для регулировки глубины обработки почвы. Культиватор движется за счет вращения фрез, одновременно разрыхляя почву. Устройство поставляется с двумя внутренними и внешними резаками. Первый тип используется на неровной почве и целине. Легкий грунт рыхлят обоими фрезами, можно добавить и третий комплект. Купите его отдельно. В итоге резцов по три с каждой стороны, а всего их 6 штук. На культиватор «Крот» нельзя поставить восемь фрез из-за повышенной нагрузки на мотор и трансмиссию.
• При прополке сорняков проводят переоборудование механизма. На внутренние фрезы снимаются ножи, а на их место ставятся прополочные. Эти детали узнаваемы по L-образной форме. Внешние фрезы заменены дисками. Они также продаются отдельно. Диски нужны для защиты растений, не допуская их попадания под прополочную машину. Если на картофеле проводится прополка, то одновременно можно проводить и предварительное окучивание. Для этого задний сошник заменяют окучником.
• Когда нужно окучить картошку, фрезы не нужны. Их снимают с вала редуктора, а на это место ставят стальные колеса с приваренными проушинами. Румпель остается на месте, где раньше был сошник.
• При уборке картофеля используются те же металлические проушины, а за культиватором сошник заменен на картофелекопалку. Этот вид навесного оборудования выпускается в различных модификациях, но обычно для культиваторов покупают веерные модели.
• Вспахивать землю можно не только фрезами, но и плугом. Он крепится к задней части машины вместо сошника. Стальные колеса остаются на месте.
• Агрегат можно использовать на сенокосе. Нужно просто купить косилку и закрепить ее перед агрегатом. На валы редуктора надеваются резиновые колеса. Передача крутящего момента обеспечивается ремнями, надетыми на шкивы культиватора «Крот» и косилки.
• Крот вполне способен заменить насос для откачки воды. Вам достаточно приобрести насосное оборудование МНУ-2, закрепить его на раме и соединить с ременной передачей. При этом важно не забыть снять ремень с тягового механизма.
• Мотокультиватор хорошо справляется с перевозкой малогабаритных грузов массой до 200 кг. Здесь нужна тележка с поворотно-сцепным механизмом. Можно приобрести заводскую модель ТМ-200 или сварить ее самостоятельно из металла. Во время перевозки грузов на валы редуктора надеваются резиновые колеса.

Как видите, благодаря дополнительному оборудованию многофункциональность Крота значительно расширена.

Модернизация МК-1А модель

Если у вас есть старая модель «Крота», не спешите ее выбрасывать. Зачем тогда переплачивать при покупке нового культиватора за раму, редуктор и другие детали, если они уже есть. Можно обойтись простой заменой мотора.

Старый двигатель можно заменить на четырехтактный LIFAN — 160F.