Цепь 260 штиль: Купить шину и цепь для бензопилы Stihl MS 260 (MS260)

Содержание

Таблица цепей и шин Stihl для бензопил, электропил, маркировка

 

а также электропил, маркировка, подбор нужной цепи, шины

В таблице найдите свою модель инструмента, и перейдите по ссылке на нужный товар.

(ТАБЛИЦА В РАЗРАБОТКЕ)

ТАБЛИЦА ЦЕПЕЙ, ШИН STIHL
Применяется к модели StihlДлина шиныШаг цепиПаз шиныКол.во звеньевСсылка 

MS 170, MS 180,

MS181, MS192(T),

MS 193; MSE140,

HT75, HT101,

HT131, HT-KM,

HTE-60, MSА 160; 200.

30 см / 12 дюймов3/8”1,1 мм44 зв.

Бухта

Цепь

Шина

MS 170, MS 180,

MS181, MS192(T),

MS 193; MSE140,

HT75, HT101, HT131,

HT-KM, HTE-60,

MSА 160; 200.

35 см / 14 дюймов3/8”1,1 мм50 зв.

Бухта

Цепь

Шина

MS180, MS181,

MS192(T),  MS200(T), MS210, MS211,

MS230, MS250,

MSE160, MSE180

25 см / 10 дюймов

1/4”

1,3 мм

56 шт.

 

MS180, MS181,

MS192(T),  MS200(T), MS210, MS211,

MS230, MS250, MSE140,

MSE160, MSE180

30 см / 12 дюймов

1/4”

1,3 мм

64 шт.

 

MS180, MS181,

MS192(T),  MS200(T), MS210, MS211,

MS230, MS250,

MSE140, MSE160,

MSE180

30 см / 12 дюймов

3/8”

1,3 мм

44 шт.

 
MS240,  MS260,  MS26132 см / 13 дюймов3/8”1,3 мм50 шт. 
MS200,  MS210,  MS211,  MS230, MS25035 см / 14 дюймов1/4”1,3 мм72 шт. 

MS180, MS181,

MS192(T),  MS200(T), MS210, MS211,

MS230, MS250,

MSE140, MSE160,

MSE180

35 см / 14 дюймов

3/8”

1,3 мм

50 шт.

 

MS180, MS181,

MS192(T),  MS200(T), MS210, MS211,

MS230, MS250,

MSE140, MSE160,

MSE180

40 см / 16 дюймов

3/8”

1,3 мм

55 шт.

 
MS240,  MS260,  MS26140 см / 16 дюймов3/8”1,3 мм60 шт. 

MS210, MS211, MS230, MS250,  MSE140,

MSE160, MSE180,

MS200(T),  MSE140, MSE160, MSE180,

MS200(T), MSE140, MSE160,

MSE180 – 61 звено)

45 см / 18 дюймов

3/8”

1,3 мм

62 шт.

 
MS240,  MS260,  MS26145 см / 18 дюймов3/8”1,3 мм66 шт. 
MS240,  MS260,  MS261,  MS270, MS280, MS290, MS39032 см / 13 дюймов

0,325”

1,5 мм

56 шт.

 
MS210, MS211, MS230, MS25035 см / 14 дюймов0,325”1,5 мм56 шт. 

MS240,  MS260,  MS261,  MS270, MS280, MS290, MS390, MS341,

MS361, MS362

37 см / 15 дюймов

0,325”

1,5 мм

62 шт.

 
MS240,  MS260,  MS261,  MS270, MS280, MS290, MS39032 см / 13 дюймов

0,325”

1,6 мм

56 шт.

 

MS240,  MS260,  MS261,  MS270, MS280, MS290, MS390, MS341,

MS361, MS362

32 см / 13 дюймов

3/8”

1,6 мм

50 шт.

 
MS210, MS211, MS230, MS25035 см / 14 дюймов0,325”1,6 мм56 шт. 

MS240,  MS260,

MS261,  MS270,

MS280, MS290,

MS390, MS341,

MS361, MS362,

MS440, MS441,

MS460,  MSE220

MS440, MS441,

MS460 – 64 звена,  

MSE220– 63звена)

37 см / 15 дюймов

0,325”

1,6 мм

62 шт.

 

MS240,  MS260,

MS261,  MS270,

MS280, MS290,

MS390, MS341,

MS361, MS362,

MS440, MS441,

MS460, MSE220  

MSE220

37 см / 15 дюймов

3/8”

1,6 мм

56 шт.

 

MS210, MS211,

MS230, MS250

40 см / 16 дюймов0,325”1,6 мм62 шт. 

MS240, 026,  MS260,  MS261, MS270,

MS280,

MS290, MS390,

MSE220,  MS341,

MS361, MS362,

MS440, MS441, MS460, MS341, MS361,MS362,

MS440, MS441,

MS460 68 звеньев

40 см / 16 дюймов

0,325”

1,6 мм

67 шт.

 

MS240, MS260,

MS261,  MS270,

MS280, MS290,

MS390, MS341,

MS361, MS362,

MS440, MS441,

MS460, MS650,

MS660, MSE220

40 см / 16 дюймов

3/8”

1,6 мм

60 шт.

 
MS650, MS66040 см / 16 дюймов0,404”1,6 мм55 шт. 
MS25045 см / 18 дюймов0,325”1,6 мм68 шт. 

MS240, MS260,

MS261,  MS270,

MS280, MS290,

MS390, MSE220,

MS341, MS361,

MS362, MS440,

MS441, MS460,

MS341, MS361,

MS362, MS440,

MS441, MS460

45 см / 18 дюймов

0,325”

1,6 мм

74 шт.

 

MS240, MS260,

MS261,  MS270,

MS280, MS290,

MS390, MS341,

MS361, MS362,

MS440, MS441,

MS460, MS650,

MS660, MSE220

45 см / 18 дюймов

3/8”

1,6 мм

66 шт.

 
MS650, MS66045 см / 18 дюймов0,404”1,6 мм60 шт. 

MS341, MS361,

MS362, MS440,

MS441, MS460,

MS290, MS390, MSE220

MS290MS390,

MSE220

50 см / 20 дюймов

0,325”

1,6 мм

82 шт.

 
MS290, MS390, MS341, MS360, MS361, MS362,  MS440, MS441, MS460,  MS460R,  MS650, MS660, MSE220

50 см / 20 дюймов

3/8”

1,6 мм

72 шт.

 
MS650, MS66050 см / 20 дюймов0,404”1,6 мм66 шт. 
MS290, MS390, MS440, MS441, MS460, MS650, MS660, MS780, MS88063 см / 25 дюймов

3/8”

1,6 мм

84 шт.

 
MS440, MS441, MS460, MS650, MS66075 см / 30 дюймов3/8”1,6 мм98 шт. 
MS780, MS880150 см / 60 дюймов0,404”1,6 мм173 шт. 

 

Бензопила STIHL MS 260 16″ (арт. 11212000423)

Дополнительные категории:

= 3, среднее ± стандартная ошибка среднего, ** P <0,005 по критерию Стьюдента t ). ( i ) Уровни ( слева ) и соотношение Aβ42/общее количество Aβ ( справа ) в de novo Aβ, полученном в бесклеточном анализе с использованием APP 695 -экспрессирующие HEK293 клеточные мембраны при различных условиях pH (7,0 или 6,0) ( n =3, среднее ± стандартная ошибка среднего, ** P <0,005 по критерию Стьюдента t ). Полноразмерные пятна для ( d ) и ( g ) можно найти на дополнительном рис. 1.

Полноразмерное изображение

Обсуждение

интернализуется посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза, который регулируется CALM. Точная субклеточная локализация активной γ-секретазы долгое время оставалась загадкой 8 . Недавние исследования, включая генетику мух, выявили преобладание процессинга Notch в эндолизосомной системе 10 . Однако маршрут доставки γ-секретазы, а также механизм ее регуляции редко описывались. Наши результаты, представленные здесь, ясно показывают, что γ-секретаза эндоцитозируется с клеточной поверхности и транспортируется в лизосомы, и что этот путь регулируется CALM. Более того, интересно, что анализ связывания показал, что CALM напрямую распознает Nct как эндоцитарную нагрузку в комплексе γ-secretase. Неожиданно значительное количество незрелых Nct было обнаружено во фракции, связанной с доменом ANTH, тогда как зрелые Nct были единственным видом, который располагался на поверхности клетки. Принимая во внимание предыдущий отчет о том, что Nct, слитый на С-конце с сигналом удержания ER, все еще был способен образовывать активную γ-секретазу и созревал 39 , стерические затруднения С-конца Nct должны возникать при сборке комплекса. Это повышает вероятность того, что пока еще неизвестные сигнальные или посттрансляционные модификации вызывают структурные изменения в цитоплазматическом домене Nct и делают возможным связывание с CALM, что приводит к усилению эндоцитоза. Мы также показали, что степень снижения общей секреции Aβ из эндогенного, стабильно экспрессируемого и транзиторно экспрессируемого АРР была различной (рис. 6f). Общая продукция Aβ коррелирует с β-расщеплением, которое требует эндоцитоза APP 9. 0155 40 . Таким образом, сверхэкспрессированный APP может перетекать в покрытые клатрином ямки, регулируемые CALM. Это может быть причиной того, что в экспериментах по нокдауну Xiao et al наблюдалось значительное снижение секреции Aβ. 19 , а также временную экспрессию APP (рис. 6f). Однако соотношение Aβ42 было изменено в мозге гетерозиготных мышей с нокаутом, в то время как общий уровень Aβ не изменился, что позволяет предположить, что изменение активности γ-секретазы более чувствительно, чем изменение АРР. Что касается физиологического значения этого CALM-зависимого эндоцитоза γ-секретазы, было показано, что процессинг Notch S3 γ-секретазой на клеточной поверхности производит стабильный NICD, начиная с остатка Val, тогда как его эндосомальный процессинг производит более короткий, нестабильный NICD, приводящий к ослабленная сигнализация 41 . Это подразумевает, что величина передачи сигналов Notch контролируется не только транспортом самого Notch, но также и транспортом γ-secretase. Регулируется ли активность γ-secretase с помощью мембранного транспорта в ответ на специфические сигнальные пути, будет важной областью для дальнейших исследований.

Также интригующим является обнаружение того факта, что потеря CALM изменяет протеолитическую активность γ-секретазы, снижая коэффициент продукции Aβ42, постоянно наблюдаемый как in vitro и in vivo . На сегодняшний день в ходе полногеномных ассоциативных исследований и полногеномного секвенирования сообщалось о нескольких защитных мутациях/вариантах против AD. Среди этих вариантов редкий вариант, вызывающий замену A673T в гене APP , снижает продукцию Aβ, влияя на β-расщепление 42 , и минорный аллель (A) rs3865444 в гене CD33 регулирует фагоцитоз Aβ микроглией 43, 44 . Учитывая тот факт, что почти все мутации, связанные с FAD, увеличивают продукцию/агрегацию Aβ in vitro , а также in vivo , модуляция уровней Aβ в головном мозге имеет решающее значение для молекулярной этиологии AD. Однако ни о каком генетическом варианте, изменяющем активность γ-secretase, не сообщалось, хотя модулятор γ-secretase рассматривался как многообещающее лечение 1 ​​ . Наш настоящий результат предполагает, что минорный аллель (A) rs10792832 около гена PICALM будет влиять на экспрессию CALM таким образом, чтобы уменьшить коэффициент продукции Aβ42, тем самым приводя к защитному эффекту против AD 9.0155 12 . Важно отметить, что сниженное соотношение Aβ42/общее количество Aβ было воспроизведено при обработке YM201636, который блокирует созревание эндосом и перераспределяет γ-секретазу в более ранний эндоцитарный компартмент. Эти результаты позволяют предположить, что изменение стационарной локализации γ-секретазы, которое определяется балансом между эндолизосомным переносом и рециклированием на клеточную поверхность, коррелирует со сниженным соотношением Aβ42/общее количество Aβ. Примечательно, что в клетках, обработанных YM201636, мы не наблюдали изменения общего уровня секреции Aβ, в то время как инкубация мембранных фракций, полученных из клеток, обработанных YM201636, увеличивала продукцию Aβ. Заманчиво предположить, что эндолизосомное созревание необходимо не только для продукции, но и для секреции Aβ. Тем не менее, истощение CALM, по-видимому, смещает баланс в сторону рециркуляции, так что γ-secretase накапливается в более раннем эндоцитарном компартменте, где она предпочтительно расщепляет APP CTF в положении Aβ40. Почему это изменение в локализации имеет значение? Биохимически было показано, что субклеточная локализация влияет на протеолитическую активность γ-секретазы, и это может быть связано с разницей в липидном составе мембраны или pH 9.0155 41,45,46 . Как показано в этом исследовании, низкий pH вызвал значительное увеличение соотношения Aβ42/общего Aβ в анализе in vitro , что указывает на то, что изменение pH наряду с созреванием эндосом влияет на активность γ-секретазы для коэффициента продукции Aβ42. Наши результаты также повышают вероятность того, что ингибирование функции CALM, а также эндосомального созревания γ-секретазы считается многообещающей терапевтической мишенью AD.

В то время как полная системная потеря CALM у мышей приводит к неонатальной смерти, возможно, из-за нарушения усвоения железа и другого важного эндоцитоза, у гетерозиготных мышей не было выявлено явных аномалий 20 . Сниженное соотношение Aβ42/общее количество Aβ в головном мозге гетерозиготных мышей предполагает, что частичного ингибирования функции CALM может быть достаточно для предотвращения развития AD с минимальными побочными эффектами. В связи с этим следует отметить, что Ca 2+ -зависимый экзоцитоз синаптических пузырьков, как было показано, модулирует конформацию PS1 и коэффициент продукции Aβ42 47 . Поскольку CALM необходим для эндоцитарного пути синаптических везикул 48 , CALM может быть критическим регулятором соотношения продукции Aβ42, зависящего от активности нейронов. Примечательно, что величина снижения отношения Aβ42 при нокдауне CALM различалась для разных конструкций APP (сравните рис. 2b, e и 3c). Одна из возможностей заключается в том, что субклеточное расположение β-расщепления АРР, которое должно предшествовать γ-расщеплению, коррелирует с этой разницей в снижении отношения Aβ42. Фактически, недавние исследования показывают, что β-расщепление АРР динамически регулируется переносом через мембрану 49,50,51 а также активность нейронов 40,52 .

SNP, обнаруженные у пациентов с поздним началом AD, связаны с заболеванием с пониженным риском, поэтому было бы интересно посмотреть, снижается ли уровень экспрессии или функция CALM в мозге пациентов, несущих эти SNP. Нокдаун CALM замедлял, но не отменял эндоцитоз γ-секретазы, предполагая, что другие факторы или молекулярные системы, включая AP180, будут дополнять перенос γ-секретазы при истощении функции CALM внутри клеток. Таким образом, мы идентифицировали CALM как регулятор эндоцитоза γ-секретазы и коэффициента продукции Aβ42. Это исследование является важным шагом вперед в понимании клеточной биологии γ-секретазы, а также в определении новой мишени для антиамилоидного лечения БА.

Методы

Молекулярная биология

CALM человека (длинная (CALM-L) и короткая (CALM-S) изоформы, регистрационный номер нуклеотида NCBI BC048259 и BC064357 соответственно) и ORF человека BACE1 (BC065492) амплифицировали из клонов IMAGE ( Open Biosystems) с использованием KOD плюс нео ДНК-полимераза (TOYOBO). Экспрессионные конструкции, кодирующие полноразмерный APP 695 человека дикого типа и C99, были описаны ранее 27 . Конструкции экспрессии млекопитающих получали с использованием вектора pEF6-V5 His TOPO TA или pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Бактериальные экспрессионные конструкции для рекомбинантных слитых белков GST получали с использованием вектора pFAT2, кодирующего Hisx6-Gultathion S-трансферазу (GST). Следующие малые интерферирующие РНК ON-TARGETplus SMARTpool (Thermo Scientific) использовали против человеческого Nct (#L-008043-00), человеческого APP (#L-003731-00), мышиного APP (#L-043246-00), человеческого СПОКОЙСТВИЕ (#L-004004-00), мышь СПОКОЙСТВИЕ (#L-041440-01). Люцифераза GL2 (#D-001100-20) и нецелевой пул (#D-001810-10) использовали в качестве контрольных siРНК. SiРНК, нацеленные на VAMP8 человека (SI 02652993 и SI04437804) были приобретены у Qiagen.

Антитела и химические вещества

Следующие антитела были приобретены у коммерческих поставщиков: анти-CALM (sc-6433, Santa Cruz, разведение 1:1000 для вестерн-блоттинга, разведение 1:400 для иммуноцитохимического анализа), анти-APPc (# 18961, Immuno-Biological Laboratories, 1:1000), антитело 82E1, специфичное к Aβ человека (#10323, Immuno-Biological Laboratories, разведение 1:1000), анти-α-тубулин DM1A (T6199, Sigma, разведение 1:2000) , N-конец анти-Nct (sc-14369, Н-19; Santa Cruz, разведение 1:1000), антитело к С-концу Nct (N1660, Sigma, разведение 1:1000), антитело к LAMP1 (#328611, меченое антитело Alexa-647, Bio Legend, разведение 1:500), антитело к EEA1 (#2411S, Cell Signaling Technology, разведение 1:200), анти-AP-2µ1 (#2386-1, Epitomics, разведение 1:1000), анти-VAMP8 (ab76021, Abcam, разведение 1:5000). Кроличье поликлональное анти-PS1 CTF-антитело G1L3 и мышиное моноклональное анти-Nct A5226A были описаны ранее 31,53 . Pitstop 2 и YM201636 были приобретены у компаний Abcam и Cayman Chemicals соответственно.

Культура клеток и РНК-интерференция

HeLa S3 (#CCL-2.2, ATCC), Neuro2a (N2a) (#CCL-131, ATCC), HT1080 (предоставлено доктором Масатоши Маки (Университет Нагоя)), HEK293 (# CCL-1573, ATCC), embryonic fibroblast cells obtained from Ncstn −/− , Psen1 −/− ;Psen2 −/− and Aph2a −/− ;Aph2b −/− мышей ( Ncstn KO, Psen1/2 DKO и Aph2a/b DKO MEF соответственно) 54,55,56 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки N2a, стабильно экспрессирующие APP 695 дикого типа человека, отбирали с использованием 50 мкг мл -1 бластицидина S (Calbiochem). Клеточные линии Flp-In T-REx-293, стабильно экспрессирующие Tet-индуцируемый человеческий APP 695 дикого типа, отбирали с использованием 200 мкг мл -1 гигромицина в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen). 9Клетки 0163 Ncstn KO MEF, стабильно экспрессирующие V5/His-меченый Nct, отбирали с использованием 10 мкг мл -1 бластицидина (Calbiochem) 57 . siРНК трансфицировали в 20~30% конфлюэнтных клеток с использованием LipofectAMINE RNAiMAX (Invitrogen) в концентрации 20 нМ, а клетки и культуральную среду анализировали через 48–72 ч после трансфекции. В экспериментах, в которых была необходима комбинация доставки siRNA и плазмиды, плазмиды трансфицировали TransIT-2020 (Mirus) или Fugene 6 (Roche Applied Science) через 24 часа после доставки siRNA.

Для иммуноцитохимического анализа клетки, культивированные на покровных стеклах, фиксировали в течение 15 минут в 4% параформальдегиде, а затем пермеабилизировали 0,2% Тх-100 в течение 10 минут. Все растворы были приготовлены в PBS. Затем покровные стекла инкубировали с первичными антителами, как указано, в течение 1 часа. После промывания PBS покровные стекла инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч, промывали PBS, помещали на предметное стекло с использованием PermaFluor Aqueous Mounting Medium (Thermo Scientific), смешанного с 1 мкг мл -1 DAPI для окрашивания ядер. Изображения были получены либо с помощью флуоресцентного микроскопа (AxioObserver Z1, Zeiss) с масляным иммерсионным объективом Plan Apochromat × 40 с числовой апертурой 1.3, программным обеспечением AxioVision, либо с помощью конфокального микроскопа (SP5, Leica) с масляным иммерсионным объективом × 63 PL APO CS с числовой апертурой 1.3. 1.4, программное обеспечение Leica LAS AF. Изображения были обрезаны и обработаны с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH). Для обнаружения совместной локализации CALM и Nct субконфлюэнтные клетки обрабатывали 30 мкМ Pitstop 2 в среде DMEM без FBS в течение 3 ч перед фиксацией.

Для вестерн-блоттинга клетки лизировали буфером для образцов Laemlli и обрабатывали ультразвуком. Концентрацию белка измеряли с использованием анализа белка BCA (Pierce). Для обнаружения APP CTF клеточные лизаты (40  мг белка) дефосфорилировали рекомбинантной протеинфосфатазой Lambda (400 единиц; New England Biolabs) в течение 4 часов при 30 °C (ссылка 58). Секретируемый Aβ человека отделяли в геле Urea-SDS PAGE 59 и определяли вестерн-блоттингом с использованием специфичного антитела 82E1 к Aβ человека.

Извлечение мозга

Все эксперименты с использованием животных в этом исследовании проводились в соответствии с рекомендациями, предоставленными Институциональным комитетом по уходу за животными Высшей школы фармацевтических наук Токийского университета. Все животные (5-месячные мыши, самки) содержались на пище и воде с 12-часовым циклом свет/темнота. Мозг, вырезанный у 5-месячных мышей Picalm +/- или мышей дикого типа, гомогенизировали в буфере RIPA (Thermo Scientific), содержащем полный коктейль ингибиторов протеазы (Roche Applied Science). Гомогенаты очищали центрифугированием при 200000× г в течение 20 мин при 4°С, и полученный супернатант собирали в виде экстракта мозга RIPA. Экстракт RIPA использовали для количественного определения Aβ с помощью ELISA (набор ELISA для бета-амилоида человека/крысы (40) (№ 294-62501, WAKO Pure Chemical Industries) и набора ELISA для человека/крысы (42) для β-амилоида (42), высокая чувствительность ( № 292-64501, WAKO Pure Chemical Industries), а также анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Для анализа in vitro BACE1 экстракт RIPA подкисляли 25  мМ CH 3 COONa, pH 4,5, и инкубировали с β- секретазо-специфический рекомбинантный пептидный субстрат JMV2236 (Bachem) при 37 °C в указанные моменты времени.Флуоресценцию фракций измеряли при 320 и 420/430 нм в качестве длины волны возбуждения и испускания соответственно0155 60 .

Анализы поглощения лиганда

Субконфлюэнтные клетки HeLa или HT1080 инкубировали в среде, содержащей 50 мкг мл -1 трансферрина Alexa-647 и 10 мкг мл -1 анти-Nct MAb при 7,7°С мин для A5226. После промывки средой добавляли свежую подогретую среду и далее инкубировали в течение различного времени при 37 °C. Затем клетки немедленно промывали PBS, фиксировали в PFA и обрабатывали для иммуноцитохимического анализа.

Анализ эндоцитоза на основе биотинилирования клеточной поверхности

Анализ эндоцитоза на основе биотинилирования клеточной поверхности проводили в соответствии с методом, установленным Bretscher и Lutter 61 с некоторыми изменениями. Вкратце, почти конфлюэнтные клетки промывали ледяным PBS, а затем инкубировали на льду с непроницаемым для мембран расщепляемым производным биотина Sulfo-NHS-SS-Biotin (Thermo Scientific, 1 мг мл –1 в PBS) для 30 мин для маркировки поверхностных белков. Избыток биотинового реагента гасили трехкратной промывкой клеток 0,1 М глицином в PBS. Клетки промывали ледяным PBS и повторно кормили предварительно подогретым и CO 2 уравновешенная питательная среда, включающая 20 мкМ GM6001 (Calbiochem) (за исключением образца «t0»). Затем клетки инкубировали в течение разного времени при 37 °C для интернализации. В каждый момент времени клетки переносили на лед для прекращения интернализации, дважды промывали охлажденным льдом PBS, а затем очищали от оставшегося поверхностного биотина путем трехкратной промывки в течение 20 минут на льду в буфере для удаления биотина (50 мМ Трис, pH 8,6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,2% очищенного БСА, 100 мМ 2-меркаптоэтансульфоната натрия (MeSNa)). После гашения MeSNa путем инкубации в течение 10 мин на льду в PBS, содержащем 120 мМ йодоуксусной кислоты, с последующим двукратным промыванием охлажденным льдом PBS клетки лизировали в PBS, содержащем 1% SDS. Затем лизаты обрабатывали ультразвуком, а биотинилированные белки улавливали стрептавидин-сефарозой (GE Healthcare) в течение 12 часов на роторном смесителе, элюировали буфером для образцов SDS при кипячении в течение 1 минуты и анализировали вестерн-блоттингом.

Экспрессия и очистка белков

Домен CALM ANTH (1–289) и белок ΔN (151–652) были экспрессированы в виде гибридных белков His-GST в Escherichia coli BL21(DE3) (WAKO). Клетки выращивали до среднего логарифма, индуцировали 0,2 мМ IPTG в течение 2,5 часов при 37 °C. Бактериальные лизаты были приготовлены из гранул путем обработки ультразвуком в буфере для лизиса E coli (20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 0,1% Triton X-100), очищены центрифугированием и слиянием His-GST. белки очищали на Ni-NTA агарозе (Qiagen) в 20 мМ трис-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола и элюировали тем же буфером, но теперь содержащим 200 мМ имидазола. Белки подвергали диализу против трис-буферного солевого раствора (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl), а затем аликвоты замораживали в жидком азоте для хранения при -80°С. HeLa, N2a и 9Лизаты клеток 0163 Ncstn KO MEF готовили с использованием буфера для лизиса клеток млекопитающих (20 мМ Tris-HCl, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100), содержащего полный коктейль ингибиторов протеазы, и предварительно очищали путем инкубации с глутатион-сефарозой (GE Здравоохранение) в течение 1 ч. В экспериментах по вытягиванию 1 мг очищенного тотального клеточного лизата и 200 мкг белков GST-CALM смешивали в лизирующем буфере. После добавления 50 мкл гранул глутатион сефарозы смесь инкубировали в течение 90 мин при 4°С на ротаторе. Гранулы глутатион-сефарозы трижды промывали лизисным буфером. После промывки к гранулам добавляли 100 мкл 2 × буфера для образцов для элюирования и кипятили в течение 1 мин. Связанные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Только GST служил в качестве отрицательного контроля.

In vitro Анализы γ-секретазы

Для уровней секретируемого Aβ, кондиционированные среды из клеток N2a, клетки HEK293, стабильно экспрессирующие человеческий APP дикого типа 695 , или клетки HeLa, совместно экспрессирующие человеческий APP дикого типа 695 и BACE1 анализировали с помощью двухсайтового иммуноферментного анализа (ELISA) 62 . Для бесклеточного анализа γ-секретазы мембраны клеток HEK293, стабильно экспрессирующих APP, собирали и анализировали, как описано ранее 63 . Всего 2,5 мг мл -1 микросом в гомогенизирующем буфере (20 мМ HEPES pH 7,0, 140 мМ KCl, 250 мМ сахарозы, 5 мМ EGTA), содержащем 0,5 мМ DIFP, 0,5 мМ PMSF, 1 мкг   ​​мл -1 TL, 9015 1 антипаин, 1 мкг мл –1 лейпептин, 10 мкг мл –1 фосфорамидон, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ . Микросомы инкубировали при 37°С в течение 6 ч, а затем центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант анализировали с помощью ELISA. В экспериментах, в которых анализы бесклеточной γ-секретазы проводились при различных условиях pH, лимонная кислота-Na 2 HPO 4 вместо буфера HEPES использовали буфер. Для анализа in vitro γ-секретазы мембраны клеток HeLa, солюбилизированные 1% CHAPSO, инкубировали с рекомбинантным субстратом на основе APP C100-Flag/Myc/His, очищенным из Escherichia coli в условиях 0,25% CHAPSO 6,64 и затем проанализированы с помощью ELISA.

Статистический анализ

Данные представлены в виде средних значений, а планки погрешностей указывают на стандартную ошибку. Группы лечения сравнивали по двусторонней шкале Стьюдента 9.0163 т -тест. Значимость была установлена ​​как * P <0,05 и ** P <0,005.

Дополнительная информация

Как цитировать эту статью: Kanatsu, K. et al. Снижение экспрессии CALM снижает отношение Aβ42 к общему количеству Aβ посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза γ-секретазы. Нац. коммун. 5:3386 doi: 10.1038/ncomms4386 (2014).

Ссылки

  1. Holtzman, D.M., Morris, J.C. & Goate, A.M. Болезнь Альцгеймера: вызов второго века. Науч. Перевод Мед. 3 , 77ср71 (2011).

    Google ученый

  2. Томита, Т. Ингибиторы и модуляторы секретазы для лечения болезни Альцгеймера. Эксперт преподобный Нейротер. 9 , 661–679 (2009).

    КАС пабмед Google ученый

  3. Томита Т. и Ивацубо Т. Структурная биология пресенилинов и сигнальных пептидаз. Дж. Биол. хим. 288 , 14673–14680 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  4. Ивацубо, Т. и др. Визуализация A beta 42(43) и A beta 40 в сенильных бляшках с моноклональными A beta, специфичными к концам: доказательство того, что первоначально депонированным видом является A beta 42(43). Нейрон 13 , 45–53 (1994).

    КАС пабмед Google ученый

  5. Li, Y.M. et al. Фотоактивируемые ингибиторы гамма-секретазы, направленные на активный центр, ковалентно метят пресенилин 1. Nature 405 , 689–694 (2000).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Google ученый

  6. Такасуги, Н. и др. Роль пресенилиновых кофакторов в гамма-секретазном комплексе. Природа 422 , 438–441 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Google ученый

  7. Де Струпер, Б. и Аннаерт, В. Новые горизонты исследований пресенилинов и гамма-секретаз в клеточной биологии и заболеваниях. Энн. Преподобный Cell Dev. биол. 26 , 235–260 (2010).

    КАС Google ученый

  8. Morohashi, Y. & Tomita, T. Транспортировка и созревание белков регулируют внутримембранный протеолиз. Биохим. Биофиз. Acta 1828 , 2855–2861 2013.

  9. Пастернак С.Х. и др. Пресенилин-1, никастрин, белок-предшественник амилоида и активность гамма-секретазы совместно локализованы в лизосомальной мембране. Дж. Биол. хим. 278 , 26687–26694 (2003 г.).

    КАС пабмед Google ученый

  10. Vaccari, T., Lu, H., Kanwar, R., Fortini, M.E. & Bilder, D. Вход в эндосомы регулирует активацию рецептора Notch у Drosophila melanogaster. J. Cell Biol. 180 , 755–762 (2008).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  11. Гарольд Д. и др. Полногеномное ассоциативное исследование выявляет варианты CLU и PICALM, связанные с болезнью Альцгеймера. Нац. Жене. 41 , 1088–1093 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  12. Lambert, J.C. et al. Метаанализ 74 046 человек выявил 11 новых локусов предрасположенности к болезни Альцгеймера. Нац. Жене. 45 , 1452–1458 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  13. Dreyling, M.H. et al. t(10;11)(p13;q14) в клеточной линии U937 приводит к слиянию гена AF10 и CALM, кодирующего нового члена семейства белков сборки клатрина AP-3. Проц. Натл акад. Sci.USA 93 , 4804–4809 (1996).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  14. Тебар, Ф. , Боландер, С. К. и Соркин, А. Белок лимфоидной миелоидной лейкемии (CALM) сборки клатрина: локализация в ямках, покрытых эндоцитами, взаимодействие с клатрином и влияние сверхэкспрессии на клатрин-опосредованный трафик. Мол. биол. Сотовый 10 , 2687–2702 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  15. Meyerholz, A. et al. Влияние истощения белка лимфоидного миелоидного лейкоза сборки клатрина на образование клатриновой оболочки. Traffic 6 , 1225–1234 (2005 г.).

    КАС пабмед Google ученый

  16. Миллер, С. Э. и др. Молекулярная основа эндоцитоза малых R-SNARE с помощью клатринового адаптера CALM. Cell 147 , 1118–1131 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  17. Джун Г. и др. Мета-анализ подтверждает, что CR1, CLU и PICALM являются локусами риска болезни Альцгеймера и выявляет взаимодействие с генотипами АРОЕ. Арх. Нейрол. 67 , 1473–1484 (2010).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  18. Treusch, S. et al. Функциональные связи между токсичностью Abeta, переносом эндоцитов и факторами риска болезни Альцгеймера у дрожжей. Наука 334 , 1241–1245 (2011).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  19. Xiao, Q. et al. Роль сборки фосфатидилинозитол-клатрина лимфоидно-миелоидного лейкоза (PICALM) в процессинге внутриклеточного белка-предшественника амилоида (APP) и патогенезе амилоидных бляшек. Дж. Биол. хим. 287 , 21279–21289 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  20. Suzuki, M. et al. Белок сборки клатрина PICALM необходим для созревания эритроидов и интернализации трансферрина у мышей. PLoS One 7 , e31854 (2012 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  21. Дафф, К. и др. Повышенный амилоид-бета42(43) в мозгу мышей, экспрессирующих мутантный пресенилин 1. Nature 383 , 710–713 (1996).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Google ученый

  22. Накано Ю. и др. Накопление мышиного амилоида бета42 в зависимости от дозы гена у мышей с «нокаутом» PS1. евро. Дж. Нейроски. 11 , 2577–2581 (1999).

    КАС пабмед Google ученый

  23. Сайто, Т. и др. Сильная амилоидогенность и патогенность Abeta43. Нац. Неврологи. 14 , 1023–1032 (2011).

    КАС пабмед Google ученый

  24. Ю. Х. и др. Процессинг АРР и синаптическую пластичность у мышей с условным нокаутом по пресенилину-1. Нейрон 31 , 713–726 (2001).

    КАС пабмед Google ученый

  25. Cai, H. et al. BACE1 является основной бета-секретазой для генерации пептидов Abeta нейронами. Нац. Неврологи. 4 , 233–234 (2001).

    КАС пабмед Google ученый

  26. Roberds, S.L. et al. Мыши с нокаутом BACE здоровы, несмотря на отсутствие первичной активности бета-секретазы в головном мозге: последствия для терапии болезни Альцгеймера. Гул. Мол. Жене. 10 , 1317–1324 (2001).

    КАС пабмед Google ученый

  27. Iwata, H., Tomita, T., Maruyama, K. & Iwatsubo, T. Субклеточный компартмент и молекулярный субдомен белка-предшественника бета-амилоида, имеющие отношение к Abeta 42-стимулирующим эффектам мутантного пресенилина 2 болезни Альцгеймера. J биол. хим. 276 , 21678–21685 (2001).

    КАС пабмед Google ученый

  28. Chyung, J. H., Raper, D. M. & Selkoe, D. J. Гамма-секретаза существует на плазматической мембране в виде интактного комплекса, который принимает субстраты и вызывает внутримембранное расщепление. Дж. Биол. хим. 280 , 4383–4392 (2005).

    КАС пабмед Google ученый

  29. Kaether, C., Schmitt, S., Willem, M. & Haass, C. Белок-предшественник амилоида и внутриклеточные домены Notch образуются после переноса их предшественников на клеточную поверхность. Traffic 7 , 408–415 (2006).

    КАС пабмед Google ученый

  30. Burgos, P.V. et al. Сортировка белка-предшественника амилоида болезни Альцгеймера, опосредованная комплексом АР-4. Дев. Cell 18 , 425–436 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  31. Хаяши И. и др. Нейтрализация активности гамма-секретазы моноклональными антителами против внеклеточного домена никастрина. Онкоген 31 , 787–798 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  32. фон Кляйст, Л. и др. Роль терминального домена клатрина в регуляции динамики покрытых ямок выявляется с помощью ингибирования малых молекул. Cell 146 , 471–484 (2011).

    КАС пабмед Google ученый

  33. Carter, L.L., Redelmeier, T.E., Woollenweber, L.A. & Schmid, S.L. Множественные GTP-связывающие белки участвуют в эндоцитозе, опосредованном покрытыми клатрином везикулами. J. Cell Biol. 120 , 37–45 (1993).

    КАС пабмед Google ученый

  34. Tian, ​​Y., Chang, J.C., Fan, E.Y., Flajolet, M. & Greengard, P. Адаптерный комплекс AP2/PICALM посредством взаимодействия с LC3 нацелен на APP-CTF болезни Альцгеймера для терминальной деградации посредством аутофагии. Проц. Натл акад. науч. США 110 , 17071–17076 (2013 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  35. Хуанг Ф., Хворова А., Маршалл В. и Соркин А. Анализ клатрин-опосредованного эндоцитоза рецептора эпидермального фактора роста с помощью РНК-интерференции. Дж. Биол. хим. 279 , 16657–16661 (2004).

    КАС пабмед Google ученый

  36. Harel, A., Mattson, M.P. & Yao, P.J. CALM, белок сборки клатрина, влияет на содержание GluR2 на клеточной поверхности. Нейромол. Мед. 13 , 88–90 (2011).

    КАС Google ученый

  37. Harel, A., Wu, F., Mattson, M.P., Morris, C.M. & Yao, P.J. Доказательства CALM в управлении торговлей VAMP2. Traffic 9 , 417–429 (2008).

    КАС пабмед Google ученый

  38. Jefferies, H.B. et al. Селективный ингибитор PIKfyve блокирует продукцию PtdIns(3,5)P(2) и нарушает эндомембранный транспорт и почкование ретровирусов. EMBO Rep. 9 , 164–170 (2008).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  39. Capell, A. et al. Сборка комплекса гамма-секретазы на раннем секреторном пути. Дж. Биол. хим. 280 , 6471–6478 (2005).

    КАС пабмед Google ученый

  40. Дас, У. и др. Индуцированная активностью конвергенция APP и BACE-1 в кислых микродоменах через эндоцитоз-зависимый путь. Нейрон 79 , 447–460 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  41. Тагами, С. и др. Регуляция передачи сигналов Notch посредством динамических изменений точности расщепления S3 Notch-1. Мол. Клетка. биол. 28 , 165–176 (2008).

    КАС пабмед Google ученый

  42. Jonsson, T. et al. Мутация в APP защищает от болезни Альцгеймера и возрастного снижения когнитивных функций. Природа 488 , 96–99 (2012).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед Google ученый

  43. Bradshaw, E.M. et al. CD33 Локус болезни Альцгеймера: измененная функция моноцитов и биология амилоида. Нац. Неврологи. 16 , 848–850 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  44. Гричук А. и др. Ген риска болезни Альцгеймера CD33 ингибирует микроглиальное поглощение бета-амилоида. Нейрон 78 , 631–643 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  45. Фукумори, А. и др. Пресенилин-зависимая гамма-секретаза на плазматической мембране и эндосомах функционально различна. Биохимия 45 , 4907–4914 (2006).

    КАС пабмед Google ученый

  46. Холмс О., Патури С., Е. В., Вулф М. С. и Селко Д. Дж. Влияние мембранных липидов на активность и процессивность очищенной гамма-секретазы. Биохимия 51 , 3565–3575 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  47. Долев И. и др. Всплески спайков увеличивают соотношение амилоид-бета 40/42, индуцируя конформационные изменения пресенилина-1. Нац. Неврологи. 16 , 587–595 (2013).

    КАС пабмед Google ученый

  48. Марицен, Т., Ку, С. Дж. и Хауке, В. Превращение СПОКОЙСТВИЯ в возбуждение: АР180 и СПОКОЙСТВИЕ при эндоцитозе и заболеваниях. биол. Cell 104 , 588–602 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  49. Buggia-Prevot, V. et al. Функция белков семейства EHD в однонаправленном ретроградном дендритном транспорте BACE1 и продукции абета при болезни Альцгеймера. Cell Rep. 5 , 1552–1563 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  50. Удаяр, В. и др. Парный скрининг сверхэкспрессии РНКи и RabGAP идентифицирует Rab11 как регулятор продукции бета-амилоида. Cell Rep. 5 , 1536–1551 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  51. Yamakawa, H., Yagishita, S., Futai, E. & Ishiura, S. Эффективность ингибитора бета-секретазы снижается из-за аберрантного бета-расщепления белка-предшественника «шведского мутанта». Дж. Биол. хим. 285 , 1634–1642 (2010).

    КАС пабмед Google ученый

  52. Каменец Ф. и др. Обработка APP и синаптическая функция. Нейрон 37 , 925–937 (2003).

    КАС пабмед Google ученый

  53. Томита, Т. и др. С-конец пресенилина необходим для сверхпродукции амилоидогенного Abeta42 посредством стабилизации и эндопротеолиза пресенилина. Дж. Неврологи. 19 , 10627–10634 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  54. Li, T. , Ma, G., Cai, H., Price, D.L. & Wong, P.C. белок-предшественник амилоида у млекопитающих. J. Neurosci. 23 , 3272–3277 (2003).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  55. Чианг, П. М., Фортна, Р. Р., Прайс, Д. Л., Ли, Т. и Вонг, П. С. Специфические домены в передней части глотки с дефектом 1 определяют его внутримембранные взаимодействия с никастрином и пресенилином. Нейробиол. Старение 33 , 277–285 (2012).

    КАС пабмед Google ученый

  56. Herreman, A. et al. Полная инактивация активности гамма-секретазы в пресенилин-дефицитных эмбриональных стволовых клетках. Нац. Клеточная биол. 2 , 461–462 (2000).

    КАС пабмед Google ученый

  57. Хаяши И. и др. Одноцепочечный вариабельный фрагмент против никастрина ингибирует активность гамма-секретазы. Дж. Биол. хим. 284 , 27838–27847 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  58. Андо, К. и др. Роль фосфорилирования белка-предшественника амилоида болезни Альцгеймера во время дифференцировки нейронов. Дж. Неврологи. 19 , 4421–4427 (1999).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  59. Qi-Takahara, Y. et al. Более длинные формы бета-амилоидного белка: последствия для механизма внутримембранного расщепления гамма-секретазой. J. Neurosci. 25 , 436–445 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  60. Такасуги, Н. и др. Активность BACE1 модулируется ассоциированным с клеткой сфингозин-1-фосфатом. J. Neurosci. 31 , 6850–6857 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  61. Bretscher, M.S. & Lutter, R. Новый метод обнаружения эндоцитированных белков. EMBO J. 7 , 4087–4092 (1988).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  62. Томита, Т. и др. Мутация пресенилина 2 (N141I), связанная с семейной болезнью Альцгеймера (семьи поволжских немцев), увеличивает секрецию бета-амилоидного белка, оканчивающегося на 42-м (или 43-м) остатке. Проц. Натл акад. науч. США 94 , 2025–2030 (1997).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  63. Какуда, Н. и др. Эквимолярная продукция внутриклеточного домена бета-амилоидного белка и белка-предшественника амилоида из бета-карбоксиконцевого фрагмента с помощью гамма-секретазы. Дж. Биол. хим. 281 , 14776–14786 (2006 г.).

    КАС пабмед Google ученый

  64. Takahashi, Y. et al. Сулиндак сульфид является неконкурентным ингибитором гамма-секретазы, который предпочтительно снижает образование Abeta 42. Дж. Биол. хим. 278 , 18664–18670 (2003 г.).

    КАС пабмед Google ученый

Скачать ссылки

Артикул № 260 STD, Конвейерные цепи для ящиков на Allied-Locke Industries

Характеристики | Обслуживаемые приложения

Технические характеристики

org/PropertyValue»> org/PropertyValue»> org/PropertyValue»> org/PropertyValue»> org/PropertyValue»> org/PropertyValue»> org/PropertyValue»>

Шаг (P)
Н/Д 10. 24

Ср. Абсолютная сила
Н/Д 68 180 кг150 000 фунтов

Рабочая нагрузка
Н/Д 27 270 фунтов

Ср. Вес
Н/Д 6,40 кг14,0 фунта

Чертеж
Н/Д Чертеж конвейера ящиков

Размер (А)
Н/Д 2,95 дюймов75,0 мм

Размер (В)
Н/Д 2,76 дюйма70 мм

Размер (С)
Н/Д 1,18 дюйма30 мм

Размер (D)
Н/Д 0,790 дюйма

Размер (E)
Н/Д 1,260 дюйма32 мм

Обслуженные приложения

org/PropertyValue»>

Н/Д конвейеры переработка молочных продуктов скребковые конвейеры пищевая промышленность перевалка зерна конвейеры повышенной грузоподъемности муниципалитеты перерабатывающие предприятия перерабатывающие заводы коммунальные услуги

Затишье перед бурей – iRunFar

Рассуждение о «затишье перед бурей», о том периоде затишья, который наступает перед «бурей» целевого забега.

Энди Джонс-Уилкинс, 13 июня 2014 г. | 1 Комментарий


Поддержите нас! iRunFar может получать небольшую комиссию за партнерские ссылки в этой статье. Учить больше.


Неделя между 23 и 16 днями из Western States всегда немного сложна для меня. Хотя, безусловно, пора начинать сокращать километры и запасаться энергией, я всегда чувствовал, что сейчас самое подходящее время для последних приготовлений в плане физической подготовки и выполнения, которые могут иметь значение между успехом и поражением в день гонки.

Таким образом, большую часть прошлой недели я потратил на калибровку своих тренировок, чтобы решить проблемы, которые не дают покоя моему разуму и телу. Во многих отношениях график тренировок на этой неделе отразил потребность моего разума в уверенности и тем самым дал последний заряд уверенности:

Суббота, 7 июня – 28 миль. Национальный парк Шенандоа с Марк Гриффин .

Предпоследняя длинная серия этого цикла. Цель сегодняшней пробежки была проста: подняться вверх, пробежаться по ровной поверхности, забить на спуске. Я выбрал курс с учетом переходов через каньоны, чтобы напомнить своему телу, как важно быстро и плавно переходить от спуска к подъему и наоборот в Western States. В целом, я был доволен результатом этого пробега и выздоровел с очень небольшим беспокойством.

Воскресенье, 8 июня – 12 миль. Я знал, что эта пробежка будет отстойной с первых нескольких шагов с парковки. Ко мне присоединились Джон Андерсен и Джейсон Фарр , и идея этого пробега заключалась в том, чтобы дождаться начала, пока не наступит жара, а затем попытаться пробежать в темповом темпе по холмистым грунтовым дорогам Альбемарля. Граф в темпе примерно на минуту или около того быстрее, чем мой обычный дневной темп на 100 миль. К сожалению, у богов погоды были другие планы на этот день, так как влажность оказалась угнетающей. 12-мильный темп превратился в 12-мильный слог смерти, оставив меня истощенным и голодным. Другими словами, это была отличная тренировка на 100 миль!

Понедельник, 9 июня – 3 мили. Одна из вещей, которую я добавил к своим тренировкам за последние три года, — это «Темповая прогулка» по понедельникам в течение последних трех недель. Эти прогулки обычно длятся около 40 минут, запланированы на самое жаркое время дня и завершаются в полном костюме грабителя банка. Если вы не уверены, что это такое, представьте себе, что вы надеваете черные колготки, облегающую шерстяную рубашку с длинным бельем, хлопковую толстовку с капюшоном, перчатки и шапку и выходите на 40-минутную прогулку в 9 часов.5-градусная жара. Это было сегодняшнее упражнение. И, хотите верьте, хотите нет, но на самом деле это было лучше, чем вчера!

Вторник, 10 июня – 7 миль. Я проснулся рано и вернулся к обычному июньскому распорядку. План состоял в том, чтобы пробежать спокойную дорогу в 7 милях от дома с целью удержать частоту сердечных сокращений ниже 65% и пробежать мили менее 8 минут. Это был один из тех забегов, который заставил меня по-настоящему поверить в ценность наработанной физической формы не только за недели и месяцы, но и за годы. Сегодняшняя пробежка была одним из тех редких случаев, когда пробежка больше похожа на прогулку в парке. Усилия были минимальными, экологические проблемы отсутствовали, а уровень энергии был заоблачным. Если бы гонка была завтра, я уверен, что выиграл бы. 🙂 Как говорят велосипедисты: «Без цепи!»

Среда, 11 июня – Темп 9 миль после разминки на 3 мили. Из многих ритуалов, которые у меня были до WS100, одним из моих любимых является одночасовая гонка Титуса Ван Рейна (TVR). Это преднамеренно децентрализованное мероприятие, организованное моим другом и гонщиком Энди Ли Ротом , представляет собой часовой забег по местной трассе, который проходит в любое время между Первомаем (1 мая) и Днем флага (14 июня).

Я подумал, что в этом году было бы забавно организовать групповой забег для TVR, поэтому я разослал приглашение, и, несмотря на проливной дождь, пугающие молнии и бешеных скунсов на втором ходу, пришло 12 человек. Мне удалось достичь своей цели чуть более 14 000 метров в час (14 083, если быть точным) и ощутить прилив уверенности в том, что я не полностью потерял всю скорость ног, которую мог накопить за эти годы.

Четверг, 12 июня – 5 миль. Сегодняшний забег должен был стать моим первым настоящим тейпер-пробегом. Плавный бег по дороге, частота сердечных сокращений в диапазоне 60 % усилий и никаких усилий, о которых можно было бы говорить. Единственное необычное в этом было то, что я намеренно бежал с мокрыми ногами, в костюме грабителя банка и с пустым желудком. Ментальная тренировка превыше всего.

Я отправляюсь на последний забег в субботу в Западной Вирджинии по адресу Highlands Sky . По общему мнению, это отличный тренер из Вестерн Стейтс, и он станет моим первым ультрамарафонцем в Западной Вирджинии. Это также будет первый раз, когда мои сыновья Карсон и Логан возьмут меня в экипаж без их матери, так как у Карсона теперь есть водительские права, а моя жена Шелли берет Талли на турнир по лакроссу в Вирджинии Бич. Должно быть весело!

До следующей недели!

Дно вверх!

 Пиво недели по версии AJW

Пиво недели на этой неделе производится компанией Epic Brewing Company в Солт-Лейк-Сити, штат Юта. Ранее на этой неделе я попробовал двойной IPA Hopulent от Epic, и это было невероятно. Он был залит нитро, и пена была удивительно кремовой и гладкой. Хотя это не совсем соответствовало стандартам Heady Topper или Pliny the Elder, это было чертовски близко.

Звонок для комментариев (от Меган)

Кто еще находится в «затишье перед бурей», на предпоследней неделе перед вашей гонкой? Как выглядели ваши тренировки на этой неделе? Каково ваше психическое состояние?

Метки: Западные штаты 100

Энди Джонс-Уилкинс финишировал в десятке лучших среди мужчин на турнире Western States 100 7 раз подряд. Его спонсируют носки Patagonia и Drymax, и он является редактором iRunFar.


Просмотреть все сообщения Энди Джонса-Уилкинса

Clothing emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов foretadrenaline.com



Одежда emoji Girls Keep Calm из 3 пижамных комплектов foretadrenaline. com

Одежда emoji Girls Keep Calm из 3 пижамных комплектов foretadrenaline.com, 3 пижамных комплекта (4) и другие пижамные комплекты на Вот ваш любимый товар. Наш широкий выбор подходит для бесплатной доставки и бесплатного возврата. Купить Emoji Girls’ Keep Calm и Emoji Flagship Stores, emoji Girls Keep Calm из 3 предметов пижамы дешево, а также множество вариантов. Официальный интернет-магазин, пижамный комплект emoji Girls Keep Calm из 3 предметов Получите лучшие новые стили для отдыха на выходных. Быстрая доставка до вашего порога.

100% хлопок, изготовлено из 00% хлопка Купить, чтобы плотно прилегать Не огнестойкий материал. Пижамный комплект из 3 предметов. Этот пижамный комплект для маленьких девочек состоит из рубашки с длинным рукавом и брюк. Дата первого перечисления: сентябрь. Размеры продукта: 0 x x 0, 8 дюймов, пижамный комплект из 3 предметов, 07, с однотонными фиолетовыми длинными рукавами и милой надписью и рисунками на рубашке. и фиолетовые брюки и брюки с узором по всей поверхности. Купить Emoji Girls ‘Keep Calm And Emoji. 4, Сохраняйте спокойствие и смайлики, Сохраняйте спокойствие для девочек с эмодзи и смайлики. ASIN: B07NT8WW8, 4, Подробный дизайн персонажей эмодзи. Вес в упаковке: 8 унций. Наш широкий выбор подходит для бесплатной доставки и бесплатного возврата. Отличный набор из 3 предметов с 1 рубашкой с длинным рукавом и 2 брюками. Wear Snug Fitting / Not Flame Resistant, официально лицензированный продукт со смайликами, указанный в размерах для девочек, одежда и другие пижамные комплекты на.

emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов


  • CUCUHAM Женское платье в стиле бохо с цветочным принтом и длинным рукавом Женское вечернее длинное платье макси
  • Thorsten Спорт на открытом воздухе Рыбалка Рыбак в лодке на озере Кольцо с принтом внутри Кольцо с гравировкой Полированное вольфрамовое кольцо Обручальное кольцо шириной 8 мм На заказ с гравировкой внутри Персонализировано от Roy Rose Jewelry
  • Ожерелье с подвеской из стерлингового серебра 925 пробы в тупике
  • FOLPPLY милый ананас с очками багажная крышка багажный чемодан дорожный протектор подходит для 18-32 дюймов
  • Cloudro Детская обувь с мягкой подошвой Нескользящая обувь для кроватки с крючками и петлями для мальчиков и девочек
  • Хорошие воспоминания Женские туфли на плоской подошве Весенняя мода Комфортные туфли на плоской подошве из натуральной кожи Женские слипоны Женские зеленые изумрудные туфли Zapatos Mujer, Orange, 11
  • Punk Rave Black Gothic Vintage Victorian Aristocrat High Waist Trousers Pants for Men
  • Президентские выборы 2020 Футболка с регланом для малышей/детей Star Mashed Clothing Harris 2020
  • 42750-2975-S Маленькие мужские арктические темно-синие Marmot Tumalo с длинным рукавом






, а также для переноски мелких предметов первой необходимости, таких как ключи от мобильного телефона, купите мужские плавки Nike Diverge 11 дюймов с принтом E-Board. Пожалуйста, выберите размер в соответствии с измерениями в описании продукта, ♥Все наши украшения покрыты специальным лаком, защищающим от потускнения, который сохранит их блеск и сияние, цифры напечатаны как часть изображения, создавая индивидуальную среду для примерки и повышенный комфорт верхней части, с хорошим качеством зрелой моды, он разработан с регулируемой тягой. Застегивайтесь на спину, чтобы обеспечить игрокам оптимальную посадку и комфорт при каждом иннинге. Добавьте роскошного и утонченного сияния любой одежде с нашей великолепной подвеской с морганитом и бриллиантами, дата первого появления: 27 сентября.0273 emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов . Как показано на рисунке, шарнирный пружинный зажим украшен смоляным верхом. Большой США = Китай X-большой: Длина: 26. Достаточно прочные для повседневного ношения, мягкие напольные коврики весят невероятные 70 унций. Подушка из 2 частей: 20 x 20 дюймов. и солнечными летними днями на улице с этим набором Expert Metal Horseshoe. сделано в США, но предлагается по прямой цене ювелирных изделий с завода. Рубашка поло с интерлоком Custom Fit. Все принты тщательно сделаны в нашей лаборатории в Тампе. ❧БЕСПЛАТНАЯ стандартная доставка по всему миру, emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов , USPS сохраняет упаковку не более 15 дней. Обязательно прочитайте вкладку «Доставка и политика», чтобы узнать, когда ваш товар будет отправлен. Мы не принимаем возвращаемые товары, наши комплекты постельного белья экологически безопасны и сертифицированы OEKO-TEX. а в верхнем ряду можно разместить предметы длиной до 6 1/8 дюйма. Спасибо за внимание и удачных покупок. ЗДЕСЬ У НАС ЕСТЬ 8 ВИНТАЖНЫХ БРАСЛЕТОВ-БРАСЛЕТОВ ХОРОШЕЙ ФОРМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ЭКСПЛУАТАЦИИ. Удивительно удобные, когда я надел их в первый раз, — сообщение мне, если вы заинтересованы в другом цвете. Это станет отличным экспонатом в вашей коллекции винтажных фотографий или ранней экспозиции, emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов . PDF выкройка куклы PDF выкройка pdf скачать тело куклы. 5 часов Lebron Signature = 17 недель на 5 часов. Вы всегда можете вырезать их по отдельности. Винтажная шкатулка для мелочей из мыльного камня, футляр с прямоугольными розовыми розами. Это будет красивый и теплый свадебный аксессуар, который согреет ваши плечи, — (маленькие карточки для заметок поставляются с конвертами цветов, показанных на картинке. Этот уникальный набор включает в себя наши изготовленные на заказ боди из мягкого хлопка с короткими и длинными рукавами, заказывайте на один размер меньше, чем ваш унисекс. размер, 5-дюймовые динамики или меньше: коаксиальные динамики — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА возможна для соответствующих покупок, применяется вдоль оси пружины, см. детали товара, чтобы узнать больше о размерах товара и мелких деталях, emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов , прост в управлении и не цепляется за лямки или одежду. Особенности: Хромированная стальная рукоятка с полипропиленовой рукояткой, подходящей для эргономики, экономит ваш труд. ✅ ПОКУПКА БЕЗ РИСКА: мы предоставляем 30-дневную гарантию возврата денег. КОЛИЧЕСТВО — В комплект входят 10 мешков из мешковины, магазинная страховочная веревка Alomejor 20 м, спасательная веревка для скалолазания, высокопрочная страховочная веревка для спасательных работ. Этот лесной член семейства лютиковых очень быстро размножается и быстро растет, образуя блестящий ковер из золотисто-желтые цветы весной. Материал:Этот спальный мешок изготовлен из высококачественной ткани, он подходит для работы/учебы/путешествий/повседневной жизни, МАТЕРИАЛ — Эти молнии изготовлены из нейлона. идеально подходит для интернет-серфинга и онлайн-игр, emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов . и т. д. для отображения на мониторе ПК или ЖК-дисплее.

emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов

AnnLoren Girls 4 июля Patriotic Stars & Stripes Tunic & Capri Holiday Outfit, supiocv Grey Prancing Unicorn Horse Children Board Shorts joggingCasual Sportcamo Shorts Beachshorts. emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов . Locomo Женские расклешенные брюки Длинные брюки Hippie Bohemian Paisley FFT260. DFBB Женский Свободный Модный повседневный пуловер с капюшоном с длинным рукавом с градиентным цветным принтом. emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов , стерлинговое серебро, 10 дюймов, полированный трехмерный ножной браслет с пухлым сердцем, карта земного шара Lightrain, карта мира, карта мира, художественное ожерелье с подвеской, винтажная бронзовая цепочка, эффектное ожерелье, ювелирные изделия ручной работы, подарки. emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов . Серебро 925 пробы с родиевым покрытием 20 мм с бриллиантовой огранкой и эмалированным медальоном в виде сердца мамы. CaliDesign Charcoal Grey red Bandana Hoodie Urban Wear Толстовка с капюшоном Blood. emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов , Подвеска Будды из стерлингового серебра для женщин.

  • Состаренное серебро Вера с подвеской в ​​виде креста
  • 5T-2XL INTERESTPRINT Boys Cats and Dogs Animal ComfortSoft Боксеры с принтом
  • Trevco Мужская футболка Queer As Folk Cast для взрослых
  • Comaba Женские толстовки с капюшоном осень-зима All-Match Slouchy Red XS
  • Мужская рабочая рубашка Orvis Tech Chambray с короткими рукавами
  • CAMSSOO Женские босоножки на высоком каблуке с ремешком на щиколотке и открытым носком, вечерние туфли-лодочки на шпильке
  • Jerry Garcia Mens Poet Absorbs the War Tie Green

emoji Girls Keep Calm Пижамный комплект из 3 предметов

KeyRing Кольцо для ключей из нержавеющей стали Keep Calm Surf Y01030

ИНФОРМАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ

COLEGIO SALLIVER, S. L., como Responsable del Tratamiento, le informa que, según lo dispuesto en el Reglamento (UE) 9, de 27 de 2016/67 (RGPD) и en la L.O. 3/2018, де 5 декабрь, де protección де datos y garantía de los derechos digitales (LOPDGDD), trataremos su datos tal y como reflejamos en la presente Política de Privacidad.

En esta Política de Privacidad describimos cómo recogemos sus datos personales y por qué los recogemos, qué hasemos con ellos, con quién los compartimos, cómo los protegemos y sus opciones en cuanto al tratamiento de sus datos personales.

Esta Política se aplica al tratamiento de sus datos personales recogidos por la empresa para la prestación de sus servicios. Si acepta лас medidas де Эста Política, acepta дие tratemos sus datos personales como себе определить en Эста Política.

КОНТАКТЫ

Социальный наименования: COLEGIO SALLIVER, S.L.
Коммерческий номер: COLEGIO SALLIVER, S.L.
CIF: B29593639
Domicilio: Avenida Finlandia, 4, 29640 Fuengirola (Malaga)
Teléfono: 952474194
E-mail: info@colegiosalliver. com
DPO: [email protected]. prestar nuestros servicios кон-эль-мас-альто-градо-де-calidad, ло дие incluye tratar sus datos кон seguridad у transparencia. Нуэстрос принципы сын:

  • Licitud: Solo recopilaremos sus Datas personales para fines específicos, explícitos y legítimos.
  • Minimización de datos: Limitamos la recogida de datos de carácter personal a lo que es estrictamente relaye y necesario para los fines para los que se han recopilado.
  • Limitación de la Finalidad: Solo recogeremos sus datos personales para los fines declarados y solo según sus deseos.
  • Точность: Mantendremos sus datos personales calculates yactualizados, en la medida de lo posible.
  • Seguridad de los Datos: Aplicamos las medidas técnicas y organizativas adecuadas y proporcionales a los riesgos para garantizar que sus datos no sufran daños, tales como divulgación o acceso no autorizado, la destrucción accidental o ilícita o su pérdida accidental o alteración y cualquier otra forma de tratamiento ilícito.
  • Acceso y Rectificación: Disponemos de medios para que acceda o rectifique sus datos cuando lo рассматривает возможности.
  • Conservación: Conservamos sus datos personales de manera legal y apropiada y solo mientras es necesario para los fines para los que se han recopilado.
  • Las transferencias internacionales: cuando se dé el caso de que sus datos vayan a ser transferidos fuera de la UE/EEE se protegerán adecuadamente. El acceso y transferencia de datos personales a terceros se llevan a cabo de acuerdo con las leyes y reglamentos aplicables y con las garantías contractuales adecuadas.
  • Marketing Directo y cookies: Cumplimos con la legislación applicable en materia de publicidad y cookies.
¿QUÉ INFORMACIÓN RECOPILAMOS?

Los tipos de datos que se pueden solicitar y tratar son:

  • Идентификационные данные, de características personales, de circunstancias sociales y académicos.
  • Экономико-информационные данные, ан су caso.

También recogemos de forma automática datos sobre su visita a nuestro site web según se description en la politica de cookies.

Siempre que solicitemos sus datos personales, le informaremos con claridad de qué datos personales recogemos y con qué fin. В общем, recogemos y tratamos sus datos personales con el propósito de:

  • Para atender sus consultas, a través de Formularios colgados en nuestra página WEB.

COLEGIO SALLIVER, S.L. нет recopila datos учтены специальные sensibles por el RGPD como сын: raza u origen étnico, мнения politicas o creencias religiosas o filosóficas, participación en sindicatos, salud, actividad сексуальная u ориентация сексуальная, datos biométricos o genéticos.

Es responsabilidad de cada interesado que los datos aportados sean verdaderos, accetos, completos y actizados y solo ellos serán responsables de cualquier daño o perjuicio, directo o косвенно, que pudiera ocasionarse como consecuencia del incumplimiento de tal.

En el caso de que los datos aportados por un Usuario pertenecieran a un tercero distinto de quien facilita los datos, el Usuario deberá informar al tercero de los aspectos contenidos en esta Política de Privacidad y obtener su autorización para facilitar as COLEGidas sus , С.Л..

¿POR QUÉ Y PARA QUÉ TRATAMOS SUS DATOS PERSONALES?

Los datos personales se recaban exclusivamente para las finalidades indicadas en la presente Política de Privacidad, fundamentadas en las siguientes baseslegitimadoras:

  • Ejecución de la relación contractual entre usted y el Centro educativo, o para la aplicación de medidas precontractuales:
    • Tramitar la solicitud de registro de usuarios en la página web, de cara a activar su suscripción, para lo que será necesario verificar su identidad.
    • Prestarte el servicio solicitado, así como realizar la facturación y el cobro del mismo, y gestionar, mantener y controlar la relación contractual con nuestros clientes, y resolves posibles dudas.
  • Законные интересы:
    • Для клиентов: Podremos Realizar Acciones o Comunicaciones Comerciales y/o publicitarias, por cualquier medio, incluso mediante comunicaciones electronicas o эквиваленты, relacionadas con los servicios del center educativo, de acuerdo con la Ley 34/2002 (LS SI).
    • Podrá oponerse a este tratamiento basado en el interés legítimo, siguiendo las indicaciones recogidas en el Apartado de Derechos de los Interesados, de esta Política de Privacidad.
  • Согласие:
    • En el caso de que usted no sea cliente: para el envío de información y publicidad sobre servicios propios del center educativo o relacionados, a través de cualquier medio, incluso mediante comunicaciones electronicas o эквиваленты.
    • Remitir información y publicidad de products y servicios de otras empresas de terceros que tengan relación con el center educativo, a través de cualquier medio, incluso mediante comunicaciones electronicas o эквиваленты.

Si no autoriza el tratamiento de sus datos personales para las anteriores finalidades, ello no afectará al mantenimiento o cumplimiento de la relación contractual que mantiene con el center educativo.

¿CÓMO OBTENEMOS SUS DATOS PERSONALES?

De la información que nos facilita cuando cumplimenta un Formulario WEB или la contratación de nuestros productos y/o servicios.

¿CON QUIÉN COMPARTIMOS ESTA INFORMACIÓN?

Los datos pueden ser comunicados a terceros para la prestación de los diversos servicios, en calidad de Encargados del Tratamiento pero no cederemos sus datos personales a terceros, salvo que estemos obligados por una ley o que usted, previa información y aceptaya acordado así con nosotros.

Compartimos su información con:

  • Prestadores de servicios contratados por (Encargados del Tratamiento). Como, por ejemplo: Nuestro servicio de hosting, informáticos o asesores jurídicos. Exigimos a todos nuestros encargados, Contractualmente, Que solo usen los datos personales facilitados para la finalidad prevista en el contrato y que, su finalización, nos los devuelvan o destruyan dichos datos personales.
  • Prestadores de servicios ubicados fuera del Espacio Económico Europeo (transferencias internacionales de datos), como por ej. EEUU1 . En estos casos, exige que dichos destinatarios cumplan con medidas diseñadas para proteger los datos personales y, para ello, se basa en mecanismos aprobados por la UE que Allowen dichas transferencias
  • Юридические обязательства: Agencia Tributaria, Administración Pública con compencia, Jueces y Tribunales и т. д.

1Decisión de Ejecución (UE)2016/1250 de la Comisión de 12 Julio de 2016 con arreglo a la Directiva 95/46 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre la adecuación de la protección conferida por el Escudo de Privacidad UE

CONSERVACIÓN DE DATOS

Los datos personales, facilitados a través de Formularios de contacto, serán conservados por un plazo maximo de 6 meses, salvo que nos indique su deseo de recibir comunicaciones conmerciales, en serván se caso used conarque se casoted meras, en serváné caso used se caso used опонга. El Resto де datos utilizados finalmente кон штрафы educativos себе conservarán пор эль tiempo Legal Que Marca ла Normativa де educación.

DERECHOS DE LOS INTERESADOS

Tiene derecho a solicitar confirmación acerca de estamos tratando sus datos personales y, si es así, a acceder a dichos datos o solicitar su portabilidad ad .

Tiene derecho a oponerse al tratamiento de sus datos (siempre tendremos en cuenta su objeción a recibir publicidad) y/o a solicitar la supresión de los mismos.

Podrá solicitar la limitación del tratamiento de sus datos en los siguientes supuestos:

  • Mientras se comprueba la impugnación de la correctitud de sus datos.
  • Si el tratamiento fuera ilícito, pero se opusiera a la supresión de sus datos.
  • Cuando el centro educativo no necesite sus datos, perusted los necesite para el ejercicio o la defensa de reclamaciones.
  • Cuando se haya opuesto al tratamiento de sus datos para el cumplimiento de una mision en interés público o para la satisfacción de un interes legítimo, mientras se verifica si los motivos legítimos para el tratamiento prevalecen sobre los suyos.

Además, puede revocar el acceptimiento prestado en cualquier momento. No obstante, tenga en cuenta que tras atender su revocación podremos seguir comunicándonos con usted cuando sea necesario para cumplir con nuestras obligaciones legales o para ejecutar el contrato que mantenga con nosotros.

Para el correcto ejercicio de sus derechos, le solicitamos que, al Formular su solicitud, acredite su identidad mediante una copy de su DNI, o documento Official Equile, e identifique la empresa (o empresas) a la que figuren vinculados sus datos, си се да эль казо. Количество каналов:

  • Карта: COLEGIO SALLIVER, S.L., AVENIDA FINLANDIA, 4 – 29640 FUENGIROLA (Málaga), indicando en el asunto «Protección de Datos»
  • Correo electronico: info@colegiosalliver.

About the author

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *